陳 坤，張潔清，李 力

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧 530000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，無孕激素拮抗的雌激素長期刺激被認為是EC發(fā)病的主要原因之一，但詳細分子和基因改變?nèi)詿o明確論斷[1]。雌激素可通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)迅速激活細胞內(nèi)的PI3K/Akt激酶級聯(lián)反應(yīng)，進而影響內(nèi)膜癌細胞的增殖與凋亡[2-3]。本課題組前期研究證實,PI3K/Akt通路對子宮內(nèi)膜癌的雌激素調(diào)控機制發(fā)揮一定作用[4]。本實驗通過慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA使PI3K基因沉默，研究E2作用下PI3K基因低表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖與凋亡的影響，旨在探討PI3K基因能否成為EC分子治療的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞(雌激素受體陽性)由北京大學(xué)婦科實驗室魏麗惠教授饋贈。慢病毒載體構(gòu)建和包裝(上海吉凱基因公司)，X-tremeGENEHP DNA轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)；PI3K引物(上海生物工程公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)；細胞周期試劑盒和Annexin-V-PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；PI3K、VEGF、bFGF抗體(美國Cell-signaling公司)；兔抗人遠紅外二抗DyLight800(美國LICOR公司)。

1.2 慢病毒表達載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染 依據(jù)說明書設(shè)計4組針對PI3K基因的siRNA，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)染細胞。利用RT-PCR和Western blot篩選出沉默效果最佳干擾靶點，siRNA序列為：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA，將選取的靶點包裝成慢病毒shRNA載體，包裝滴度為8×108TU/mL,感染Ishikawa細胞。將感染目的基因的Ishikawa細胞，經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細胞株(預(yù)實驗)。慢病毒LV-PI3K-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞，實驗分為3組：PI3K組：轉(zhuǎn)染LV-PI3K-RNAi慢病毒的Ishikawa細胞；NC組：轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒的Ishikawa細胞；Control組：未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞。將Ishikawa細胞按1×105細胞/孔接種于6孔板，待細胞融合率約為50%時，將LV-PI3K-RNAi慢病毒和陰性對照慢病毒以MOI=50加入細胞中，加終濃度為5μg/mL的polybrene增強感染效率，8h后更換正常細胞培養(yǎng)液。72h后用熒光顯微鏡觀察，評估轉(zhuǎn)染效率。熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測PI3K mRNA表達：PI3K上游引物為5'-TGGAAGCAGCAACCGAAAC-3'，下游引物為5'-CATTGAGGGAGTCGTTGT-3'；Western blot檢測PI3K蛋白的沉默表達效果。

1.3 qRT-PCR及Western blot檢測E2刺激對PI3K基因沉默后Ishikawa細胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白的表達 實驗分4組：PI3Ki組：E2刺激前期構(gòu)建的PI3K-RNAi細胞；Ishikawa組：加1×10-6mol/L E2作用Ishikawa細胞30min；NC組：E2作用轉(zhuǎn)染了陰性對照慢病毒的Ishikawa細胞；對照組：僅加入無血清DMEM培養(yǎng)基。取各組細胞，提取總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；94℃變性10s，62℃(收集熒光)60s，40個循環(huán)。采用(2-ΔΔCt)法進行相對定量分析。實驗重復(fù)3次，取均值。收集各組細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白，行SDS-PAGE電泳分離，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1h，分別加一抗VEGF(1∶100)、bFGF(1∶1000)，4℃孵育過夜，再加入兔抗人遠紅外二抗DyLight800室溫孵育1h，含0.05%Tween-20的枸櫞酸鹽緩沖液(TBST)洗膜；用紅外二抗掃膜儀Odssey掃膜并分析數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 MTT檢測細胞增殖 將處理后細胞按7000細胞/孔接種于96孔板，每組5個復(fù)孔，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；PBS清洗細胞，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,各組加1×106mol/L的E2，對照組繼續(xù)用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)；分別于1～7天，每天取出一塊培養(yǎng)板，每孔加20μL 5mg/mL MTT，孵育2h。棄培養(yǎng)液，各孔加150μL DMSO，震蕩15min，用酶標(biāo)儀在490nm處測定每孔吸光度值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將細胞按1×106細胞/孔接種于6孔板，按說明書對各組細胞進行加藥處理，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染慢病毒表達載體后PI3K基因及蛋白的沉默效果 PI3K組的PI3K mRNA抑制率為(8.67±3.06)%,PI3K蛋白抑制率為(28.01±4.36)%。與Control組及NC組比較，PI3K基因表達明顯抑制(P<0.05)。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染慢病毒表達載體后PI3K基因及蛋白的沉默效果

2.2 沉默PI3K基因后E2對各組細胞VEGF、bFGF表達的影響 PI3Ki組細胞中VEGF mRNA及蛋白表達水平與Ishikawa組、NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；后兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 E2對沉默PI3K基因后的各組細胞VEGF bFGF基因及蛋白表達

2.3 MTT法檢測PI3K低表達對Ishikawa細胞增殖能力的影響 與Ishikawa組及NC組比較，PI3Ki組細胞的增殖能力明顯減弱(P<0.05)；前兩組比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 PI3K基因沉默后E2對各組細胞后增殖的變化

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 PI3Ki組細胞的中晚期凋亡率高于Ishikawa組[(5.93±0.94) vs (2.92±0.51)],總凋亡率(%)高于Ishikawa組[(10.75±0.54)vs(6.80±0.35)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。Ishikawa組的總凋亡率(%)與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(6.80±0.35)vs(7.15±0.25)，P>0.05]。見圖3。

圖3 PI3K基因沉默后E2對Ishikawa細胞凋亡的影響

3 討 論

婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程常常伴隨著基因突變和信號通路的異常激活與持續(xù)活化，PI3K(磷脂酰肌醇三激酶)作為PI3K/Akt/mTOR通路的重要細胞信號分子，參與了一系列女性癌癥的發(fā)生，如乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等。PI3K與細胞表面的各類受體相互作用導(dǎo)致自身構(gòu)象改變而激活，被激活的PI3K將底物4，5-二磷酸脂酰肌醇[PI(4，5)P2]磷酸化成3，4，5-三磷酸酯酰肌醇[PI(3，4，5)P3]，使其作為細胞內(nèi)的第二信使與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合并促使其構(gòu)象發(fā)生改變，暴露PI3K下游蛋白Akt的結(jié)合位點：Ser473和Thr308，進而啟動一連串下游靶基因促進細胞的增殖遷徙和血管生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，E2能以依賴于ER的方式和不依賴于ER的方式在Ishikawa中迅速激活PI3K/Akt信號通路[6]，表明探索子宮內(nèi)膜癌致病相關(guān)信號通路時不能忽略雌激素的潛在效應(yīng)。結(jié)合Gu等的裸鼠移植瘤實驗[7]，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt通路可恢復(fù)癌細胞中的PR表達并激活經(jīng)典PR途徑，逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌中的孕激素抵抗。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上相關(guān)分子和檢測雌孕激素與該通路的相互作用已成為子宮內(nèi)膜癌抑癌治療方案。

實體瘤釋放分子信號到周圍正常組織，激活相關(guān)基因生成蛋白來促進血管新生以維持腫瘤內(nèi)部血供和營養(yǎng)輸送，晚期腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移也與之息息相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種內(nèi)皮細胞特有促分裂原[8]，防止內(nèi)皮細胞凋亡，促進其生長和增殖，調(diào)節(jié)血管通透性正向調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，而bFGF可通過促進VEGF表達直接誘導(dǎo)腫瘤血管形成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，E2能激活子宮內(nèi)膜癌細胞Akt通路，產(chǎn)生VEGF、bFGF，促進血管生成因子的表達，促進腫瘤增殖侵襲轉(zhuǎn)移。PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路是抗凋亡、促增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化的Akt可增加NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，增加腫瘤細胞的運動功能，有助于癌細胞侵襲[9]。本研究結(jié)果顯示，PI3K低表達可干擾E2促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和抑制子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。

綜上所述，抑制PI3K表達可降低E2作用子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及抑制凋亡的影響，為子宮內(nèi)膜癌治療提供新的思路。