宋芷霜,郭寶芝,劉愛珍,丁俊珊,王寶金

(1.鄭州市婦幼保健院婦科，鄭州 450000;2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科 河南省卵巢惡性腫瘤國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。卵巢癌缺乏早期有效的診斷方法，多數(shù)患者就診時已處于晚期，術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。因此，需進(jìn)一步探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，且兩者還存在相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5]。GNAS的反義RNA1(GNAS-AS1)是一種lncRNA，定位于20號染色體。GNAS-AS1在多種腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Liu等[6]研究顯示，GNAS-AS1在ER(+)乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯增加，其通過直接海綿化miR-433-3p加速M(fèi)2巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)了ER(+)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為ER(+)乳腺癌的治療提供了新的靶標(biāo)。目前GNAS-AS1對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響和調(diào)控機(jī)制還未知。Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，GNAS-AS1可能靶向結(jié)合并調(diào)控miR-2116-3p表達(dá)。但是，miR-2116-3p對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響尚未知。因此，本研究以GNAS-AS1/miR-2116-3p軸為出發(fā)點，探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以期為卵巢癌的靶向治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 正常人卵巢上皮細(xì)胞HUM-CELL-0088及卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3和A2780(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);胎牛血清(FBS)(浙江天杭);RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美);PCR引物、GNAS-AS1的小干擾RNA(si-GNAS-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、GNAS-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-GNAS-AS1)、空載體(pcDNA-NC)、miR-2116-3p模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-2116-3p抑制劑(anti-miR-2116-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、GNAS-AS野生型質(zhì)粒(WT-GNAS-AS1)和突變型質(zhì)粒(MUT-GNAS-AS1)(上海生工);Western blot實驗所需抗體(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HUM-CELL-0088、SKOV3、OVCAR3和A2780細(xì)胞，均加含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞融合至80%左右時，胰蛋白酶消化，將細(xì)胞按2.5×104細(xì)胞/孔接種于24孔板，培養(yǎng)2h，收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞中GNAS-AS1和miR-2116-3p表達(dá)水平。

1.2.2 RT-qPCR檢測GNAS-AS1和miR-2116-3p表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃ 3min，95℃ 10s，58℃ 45s，72℃30s，共35個循環(huán)。引物序列：GNAS-AS1上游5'-GATAAGGAGTTGAGGCCCCA-3'，下游5'-CGCCCAAGACTTAGTTCTGC-3';miR-2116-3p上游5'-ACGTGCCAATCGTAGTCGAAC-3'，下游5'-CTGGTACACACGTCTACATCG-3';GAPDH上游5'-GTCATCGTCCCACATCGCTAC-3'，下游5'-CGTGTGAAACTGTACCTAACG-3';U6上游5'-CGGCTCGTCCATATGCAAT-3'，下游5'-CTGTTGTACCGGCTACGACTG-3'。2-△△Ct法計算GNAS-AS1和miR-2116-3p水平，GNAS-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-2116-3p以U6為內(nèi)參。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組 將SKOV3細(xì)胞按6.25×104細(xì)胞/孔接種于6孔板。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-GNAS-AS1(si-GNAS-AS1組)、pcDNA-GNAS-AS(pcDNA-GNAS-AS1組)、pcDNA-NC(pcDNA-NC組)、miR-2116-3p mimcs(miR-2116-3p組)、miR-NC(miR-NC組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-2116-3p(anti-miR-2116-3p組)、共轉(zhuǎn)染si-GNAS-AS1與anti-miR-NC(si-GNAS-AS1+anti-miR-NC)、si-GNAS-AS1+anti-miR-2116-3p(si-GNAS-AS1+anti-miR-2116-3p組)。同時設(shè)空白對照組(NC組)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染6h，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 調(diào)整各組細(xì)胞密度為2.5×104細(xì)胞/ml，以200μL/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24h，加10μl CCK-8試劑，再孵育2h，于酶標(biāo)儀450nm處測定吸光度值(A)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實驗 調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104細(xì)胞/ml。遷移實驗：將Transwell小室置于24孔板，上室加200μl細(xì)胞懸液，下室加500μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h，4%多聚甲醛固定25min，0.4%結(jié)晶紫染色15min，顯微鏡觀察，隨機(jī)取5個視野，遷移細(xì)胞計數(shù)。侵襲實驗：Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干，加200μl細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實驗。

1.2.6 Western blot實驗 按2.5×104細(xì)胞/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞。RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法對蛋白定量。以20μg/孔蛋白行SDS-PAGE電泳，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。置5%脫脂奶粉溶液中封閉1h，分別置于CyclinD1(1∶500)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)、N-Cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)和E-cadherin(1∶1000)一抗孵育液，4℃過夜，置山羊抗兔二抗(1∶5000)孵育液，37℃ 1h。加顯影液，避光顯影后曝光拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將SKOV3細(xì)胞按6.25×104細(xì)胞/孔接種于6孔板。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-GNAS-AS1與miR-2116-3p mimcs或miR-NC、MUT-GNAS-AS1與miR-2116-3p mimcs或miR-NC。轉(zhuǎn)染6h，更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌細(xì)胞系中GNAS-AS1和miR-2116-3p表達(dá)水平 與正常人卵巢上皮細(xì)胞HUM-CELL-0088比較，卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3和A2780中GNAS-AS1表達(dá)升高(P<0.05)，miR-2116-3p表達(dá)降低(P<0.05)，且SKOV3細(xì)胞中GNAS-AS1和miR-2116-3p表達(dá)差異最顯著(P<0.05)，故選擇SKOV3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

表1 卵巢癌細(xì)胞系中GNAS-AS1和miR-2116-3p表達(dá)水平

2.2 下調(diào)GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-GNAS-AS1組SKOV3細(xì)胞中GNAS-AS1表達(dá)水平降低(P<0.05)，細(xì)胞吸光度值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Western blot檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表2 下調(diào)GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 上調(diào)miR-2116-3p對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-2116-3p組SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞吸光度值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表3 上調(diào)miR-2116-3p對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 GNAS-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-2116-3p表達(dá) GNAS-AS1和miR-2116-3p的結(jié)合位點見圖3。miR-2116-3p mimics與WT-GNAS-AS1共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光素酶活性降低(P<0.05);miR-2116-3p mimics與MUT-GNAS-AS1共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。si-GNAS-AS1組SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)水平高于si-NC組(P<0.05)，pcDNA-GNAS-AS1組SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)水平低于pcDNA-NC組(P<0.05)，見表5。

圖3 GNAS-AS1和miR-2116-3p核苷酸序列的結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果

表5 GNAS-AS1對miR-2116-3p表達(dá)的影響

2.5 下調(diào)miR-2116-3p逆轉(zhuǎn)下調(diào)GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-2116-3p組SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，細(xì)胞吸光度值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與si-GNAS-AS1+anti-miR-NC組比較，si-GNAS-AS1+anti-miR-2116-3p組SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，細(xì)胞吸光度值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖4、表6。

圖4 Western blot檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表6 下調(diào)miR-2116-3p逆轉(zhuǎn)下調(diào)GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.6 EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 與si-NC組比較，si-GNAS-AS1組SKOV3細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-2116-3p組SKOV3細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與si-GNAS-AS1+anti-miR-NC組比較，si-GNAS-AS1+anti-miR-2116-3p組SKOV3細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖5、表7。

圖5 Western blot法檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

表7 Western blot法檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

3 討 論

卵巢癌早期缺乏典型的臨床癥狀，且卵巢位置隱蔽，多數(shù)患者確診時已處于晚期，預(yù)后較差[7]。因此，積極探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并尋找新型的特異性分子標(biāo)記物對卵巢癌的診斷和治療具有重要意義。lncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等惡性生物學(xué)行為，可作為腫瘤治療的潛在分子靶點。研究表明，TUSC7[8]、CTBP1-AS2[9]和NPBWR1-2[10]等lncRNA在卵巢癌中呈低表達(dá)，作為抑癌基因參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。而OIP5-AS1[11]、PROX1-AS1[12]和CDKN2BAS[13]等lncRNA在卵巢癌中呈高表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

GNAS-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在多種腫瘤中異常表達(dá)。如Wang等[14]研究顯示，GNAS-AS1在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中表達(dá)上調(diào)，其通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在NPC中發(fā)揮致癌作用。Li等[15]研究顯示，GNAS-AS1在非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高，且其高表達(dá)的患者預(yù)后較差，其通過靶向結(jié)合miR-4319上調(diào)NECAB3表達(dá)促進(jìn)NSCLC的發(fā)展進(jìn)程，可作為NSCLC治療的潛在靶標(biāo)。目前GNAS-AS1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制還未知。

本研究顯示，GNAS-AS1在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3和A2780中的表達(dá)明顯高于HUM-CELL-0088，提示其作為促癌基因促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程;下調(diào)SKOV3細(xì)胞中GNAS-AS1的表達(dá)后，SKOV3細(xì)胞吸光度值及遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低，說明GNAS-AS1表達(dá)可有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞增殖[16]。MMP-2和MMP-9可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[17]。本研究還顯示，下調(diào)GNAS-AS1表達(dá)降低了SKOV3細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，與相關(guān)報道結(jié)果一致[18]，進(jìn)一步表明下調(diào)GNAS-AS1抑制了SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞失去上皮特性同時獲得間質(zhì)特性，且具有運(yùn)動能力的生物學(xué)過程。上皮源性的惡性腫瘤細(xì)胞通過EMT時失去細(xì)胞間連接，遷移能力增強(qiáng)，從而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力。E-cadherin表達(dá)降低及N-Cadherin和Vimentin表達(dá)升高是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的重要標(biāo)志[19]。本研究顯示，下調(diào)GNAS-AS1表達(dá)促進(jìn)了SKOV3細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)，而抑制了N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)，與相關(guān)報道結(jié)果一致[20]，表明下調(diào)GNAS-AS1抑制了SKOV3細(xì)胞的EMT過程。

lncRNA可與miRNA競爭性結(jié)合調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱皺z測GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞中miR-2116-3p表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，GNAS-AS1在SKOV3細(xì)胞中與miR-2116-3p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控其表達(dá)，這與本文卵巢癌細(xì)胞系中GNAS-AS1的表達(dá)升高而miR-2116-3p的表達(dá)降低的結(jié)果一致。研究顯示，LINC01433在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，其通過競爭性結(jié)合miR-2116-3p并上調(diào)MYC表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT，并抑制細(xì)胞凋亡，LINC01433/miR-2116-3p/MYC軸為乳腺癌的治療提供了新的靶點[21]。目前，miR-2116-3p對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。本研究顯示，上調(diào)miR-2116-3p表達(dá)降低了卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)其表達(dá)則具有相反的作用，表明miR-2116-3p在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還顯示，下調(diào)miR-2116-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)GNAS-AS1對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，表明下調(diào)GNAS-AS1通過靶向負(fù)調(diào)控miR-2116-3p影響卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，GNAS-AS1在卵巢癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可有效降低卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其可能通過與miR-2116-3p競爭性結(jié)合負(fù)調(diào)控其表達(dá)發(fā)揮作用，GNAS-AS1/miR-2116-3p軸可能為卵巢癌的治療提供了新的靶點。