朱 琳,潘孝華,孫 磊,何 靜,3,肖 蘭,顏士杰

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,合肥230020;3.安慶市立醫(yī)院婦產(chǎn)科,安慶 246003)

近期研究證實(shí)，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡密不可分，免疫療法在卵巢癌中展示了良好的臨床應(yīng)用前景[1-2]。大量實(shí)驗(yàn)和臨床報(bào)道均證實(shí)，干擾素具有抗腫瘤作用，可明顯延長腫瘤患者無進(jìn)展生存期，而單一免疫療法不能徹底抑制腫瘤生長。免疫療法聯(lián)合化療藥物可實(shí)現(xiàn)對腫瘤的協(xié)同抑制，推進(jìn)其在腫瘤治療中的應(yīng)用。Ⅲ型干擾素(IFN-γ)是一組新型干擾素，主要包括IL-29、IL-28A及IL-28B，其可通過激活細(xì)胞信號通路發(fā)揮抗病毒、抗增殖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。Ⅲ型干擾素結(jié)構(gòu)與Ⅰ型干擾素相似，功能卻較Ⅰ型干擾素強(qiáng)，且需與受體結(jié)合才能起效，這一特點(diǎn)可減少常用白介素導(dǎo)致的發(fā)熱、疲勞不適等不良反應(yīng)[4]。研究證實(shí)，IL-28B可增強(qiáng)順鉑對頭頸部腫瘤細(xì)胞的毒性作用[5]，目前關(guān)于IL-28A與卵巢癌發(fā)生及IL-28A聯(lián)合化療抗腫瘤的研究均未見報(bào)道。本研究擬探討IL-28A增加順鉑對卵巢癌細(xì)胞毒性作用及可能機(jī)制，為研發(fā)基于IL-28A的卵巢癌免疫化療療法提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 順鉑(山東齊魯制藥)，重組人IL-28A(rhIL-28A)、IL-28A及IL-10R2兔多克隆抗體(美國Abcam)，MICA(H-300)兔多克隆抗體(美國Santa Cruz);Annexin V-FITC試劑盒(南京凱基)，Trizol試劑(美國Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix(日本TaKaRa)，CCK-8及LDH檢測試劑盒(上海碧云天)，抗PE免疫磁珠(德國美天妮)，IL-28A ELISA試劑盒(美國R&D)。

1.1.2 組織樣本 選取2017年1月至2018年9月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科且均經(jīng)病理學(xué)診斷為卵巢癌的患者53例，F(xiàn)IGO分期：I、II期20例，III、IV期33例。同期因子宮肌瘤需手術(shù)患者28例(留取正常卵巢上皮)。卵巢癌組患者的平均年齡(49.1±10.2)歲，對照組平均年齡(46.5±9.6)歲。排除自身免疫病及其他系統(tǒng)腫瘤，術(shù)前均未接受新輔助化療、免疫及靶向治療。研究對象均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.3 細(xì)胞株 卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株C13K為本室保存，HOSEPIC購自武漢大學(xué)生物保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C13K和HOSEPIC細(xì)胞于含15%小牛血清1640培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 IL-28A預(yù)處理及順鉑干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組 陰性對照組、PBS組及rhIL-28A(100ng/ml)組，各組均順鉑(60μmol/L)干預(yù)24h。

1.2.3 CCK-8檢測順鉑IC50及細(xì)胞存活率 將各組細(xì)胞按1×104細(xì)胞/孔接種至96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h。IC50檢測：順鉑(0～200μmol/L)培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)基，加10μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h，570nm波長各孔細(xì)胞OD值。IC50=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。細(xì)胞增殖：DDP(60μmol/L)培養(yǎng)24h，加10μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h，450nm波長處各孔吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶消化細(xì)胞，0.01mol/L冰PBS 0.5ml重懸細(xì)胞，1000r/min離心5min,去除培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，棄上清，收集細(xì)胞。200μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加10μl Annexin V-FITC和5μl PI，室溫避光孵育30min，加300μl Binding Buffer，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Cell Quest軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 NK細(xì)胞分離與純度檢測 將健康志愿者外周靜脈血沿管壁加至淋巴細(xì)胞分離液離心管，3000r/min離心20min，得到外周血單個核細(xì)胞;1×107細(xì)胞加80μl PBS緩沖液和20μl抗CD56免疫磁珠，4℃孵育15min;1×107細(xì)胞加1ml緩沖液，1000r/min離心10min，去上清;1×108細(xì)胞加500μl緩沖液，混勻加至MiniMACS磁場分離，無菌試管收集陰性細(xì)胞，500μl緩沖液沖洗3次;取下柱子，加1ml培養(yǎng)基，將分選陽性細(xì)胞推入無菌試管，流式檢測CD3-CD16+CD56+細(xì)胞即NK-細(xì)胞純度。

1.2.6 LDH釋放法檢測細(xì)胞殺傷活性 按5×103細(xì)胞/孔加至培養(yǎng)孔，設(shè)3個復(fù)孔。以新鮮分離NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按效靶比(10∶1)加NK細(xì)胞50μl。常規(guī)培養(yǎng)條件下孵育6h，吸取上清50μl，加至96孔酶標(biāo)板，加LDH底物反應(yīng)液和終止液。檢測LDH值，根據(jù)LDH檢測試劑盒中公式計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞中IL-28水平 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測，重復(fù)2次。讀取450nm處吸光度值，根據(jù)陽性蛋白對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品IL-28A濃度。

1.2.8 Real Time-PCR檢測IL-28A、IL-10R2和MICA mRNA水平 收集組織標(biāo)本及順鉑作用各組細(xì)胞，將組織樣本置液氮中研磨成勻漿，Trizol法提取組織和細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列：IL-28A上游5'-GCCCAGTTCAAGTCCCGT-3'，下游5'-GGTCATGTTCTCCCACACCT-3';IL-10R2上游5'-TGGATGACACCATTATTGGACCC-3，下游5'-TTTGCTCACAGACAGGCTCACTC-3';MICA上游5'-AACCCTGACTGCACAGATCC-3'，下游5'-ATCTTCCCTTTTGCACCTCC-3';β-actin上游5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。2△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中不同基因mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 免疫熒光染色 將各組細(xì)胞按2.5×104細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，放入蓋玻片，細(xì)胞貼壁后加順鉑繼續(xù)培養(yǎng)24h。預(yù)冷100%甲醇，-20℃固定細(xì)胞5min;0.5%Triton-PBS破膜5～10min。0.2% Triton-PBS漂洗3次，5% BSA封閉1h，MICA抗體(1∶200)4℃孵育過夜;0.2% Triton-PBS漂洗3×10min;羊抗兔IgG-FITC(1∶500)37℃孵育1h;0.2% Triton-PBS漂洗3×10min，PI復(fù)染核5～7min，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。胞質(zhì)中FITC標(biāo)記MICA蛋白表達(dá)綠色熒光為表達(dá)陽性。

1.2.10 Western blot法檢測IL-28A及IL-10R2蛋白水平 50μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜;5% BSA室溫封閉2h，0.05% Tween20的TBS緩沖液(TBST)漂洗，10min×3次;加IL-28A(1∶1000)及IL-10R2(1∶1000)一抗，GAPDH一抗(1∶5000)，4℃過夜，1×TBST漂洗3遍，對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5000)，37℃搖床溫育2h，ECL顯色曝光，采集照片。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織及細(xì)胞中IL-28A基因表達(dá) Real time-PCR證實(shí)，正常卵巢上皮組織及細(xì)胞中IL-28A表達(dá)水平分別為4.78±1.24和13.63±4.32，均顯著高于卵巢癌組織和細(xì)胞(1.24±0.71和1.37±0.93)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

2.2 細(xì)胞IC50、細(xì)胞存活率及凋亡率比較 順鉑作用24h，IL-28A組C13K細(xì)胞對順鉑的IC50由(95.37±1.20)μmol/L降至(51.72±1.07)μmol/L(P=0.000)。單獨(dú)rhIL-28A預(yù)處理對C13K細(xì)胞活性無顯著影響，但與順鉑共用時IL-28A組細(xì)胞存活率顯著降低(P=0.000)(表1)。rhIL-28A對C13K細(xì)胞凋亡無直接影響，與順鉑共用時C13K細(xì)胞凋亡率顯著增加(P=0.000)(表1)。

表1 細(xì)胞存活及凋亡率比較

2.3 IL-28A提高NK細(xì)胞對C13K細(xì)胞殺傷活力 NK細(xì)胞效靶比10:1共培養(yǎng)6h，IL-28A組NK細(xì)胞對C13K細(xì)胞殺傷活性顯著增加，NK細(xì)胞對C13K細(xì)胞的殺傷活性由IL-28A預(yù)處理前(25.87±0.95)%升至(39.26±1.95)%，與陰性對照組和PBS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

2.4 ELISA檢測上清液中IL-28A表達(dá) ELISA檢測結(jié)果顯示，順鉑作用24h，IL-28A組上清液中IL-28A水平較陰性對照組及PBS組明顯升高(P=0.000)(圖1)。

圖1 上清液中IL-28A表達(dá)水平比較**P<0.01 vs 陰性對照組、PBS組

2.5 IL-28A、IL-10R2和NKG2D配體MICA mRNA水平 順鉑作用24h，IL-28A組C13K細(xì)胞中IL-28A、IL-10R2及MICA mRNA表達(dá)均顯著升高，與陰性對照組和PBS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(表2)。

表2 IL-28A、IL-10R2和MICA mRNA表達(dá)

2.6 MICA蛋白表達(dá) 激光共聚焦顯微鏡顯示，MICA蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，順鉑作用24h，與陰性對照組及PBS組比較，IL-28A組C13K細(xì)胞中MICA蛋白表達(dá)明顯升高(圖2)。

圖2 細(xì)胞中MICA蛋白表達(dá)比較(×600)A：陰性對照組;B：PBS組;C：IL-28A組;藍(lán)色熒光：DAPI染色細(xì)胞核;綠色熒光：FITC熒光二抗標(biāo)記MICA表達(dá)

2.7 IL-28A及IL-10R2蛋白表達(dá) Western blot法結(jié)果顯示，順鉑作用24h，與陰性對照組及PBS組比較，IL-28A組C13K細(xì)胞中IL-28A及IL-10R2蛋白表達(dá)均明顯上升(圖3)。

圖3 細(xì)胞中IL-28A及IL-10R2蛋白表達(dá)比較

3 討 論

目前IFN-γ的研究已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。盡管IFN-γ的抗腫瘤效果不如IFNα/β，但I(xiàn)FN-γ與化療藥物聯(lián)用可達(dá)到協(xié)同抗腫瘤作用，如IFN-γ聯(lián)合化療在治療舌鱗癌中具有協(xié)同效果[6]。目前已證實(shí)IL-28A有抗增殖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及評估化療療效作用[7]。IL-28受體IL-10R2是一種異二聚體型Ⅱ類細(xì)胞因子受體，IL-28A與IL-10R2結(jié)合后形成異源二聚體，從而激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但是，在卵巢癌細(xì)胞中，IL-28A與化療藥物是否有協(xié)同作用未見報(bào)道。

本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織和細(xì)胞中IL-28A mRNA表達(dá)顯著低于正常卵巢上皮組織及細(xì)胞，表明IL-28A低表達(dá)與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示，rhIL-28A與順鉑聯(lián)合后，細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，順鉑對C13K細(xì)胞IC50值顯著降低，而rhIL-28A單獨(dú)干預(yù)對卵巢癌細(xì)胞卻無此效果，提示IL-28A聯(lián)合順鉑對C13K細(xì)胞具有協(xié)同效果。

NK細(xì)胞是機(jī)體防御腫瘤的重要效應(yīng)細(xì)胞，NK細(xì)胞數(shù)量改變和功能缺陷與晚期卵巢癌腹腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。IFN-γ對NK細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)功能具有重要調(diào)節(jié)作用[9]。另有研究證實(shí)，IL-28A誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴于NK細(xì)胞的產(chǎn)生[10]。NK細(xì)胞表面NKG2D(自然殺傷細(xì)胞2族成員D)受體及其配體MICA在活化NK細(xì)胞過程中起到十分關(guān)鍵的作用。晚期腫瘤患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)明顯降低，其介導(dǎo)的NK細(xì)胞免疫監(jiān)視作用減弱[11]。NKG2D配體廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，各種形式刺激如熱休克、DNA損傷等均可誘導(dǎo)NKG2D配體表達(dá)[12]。順鉑可上調(diào)MHC I類鏈相關(guān)分子A/B表達(dá)，并與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后良好有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-28A預(yù)處理可增加NK細(xì)胞對C13K細(xì)胞殺傷力，順鉑作用后，隨著IL-28A水平升高，C13K細(xì)胞中IL-10R2及MICA mRNA及蛋白水平均明顯升高，IL-28A可誘導(dǎo)C13K細(xì)胞表達(dá)MICA蛋白。

綜上所述，卵巢癌組織中IL-28A水平較正常卵巢上皮顯著降低，提示IL-28A與卵巢癌相關(guān);IL-28A可協(xié)同增強(qiáng)順鉑對卵巢癌細(xì)胞的毒性作用，其機(jī)制可能與IL-28A阻斷C13K細(xì)胞增殖信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;另一方面，IL-28A通過與IL-10R2結(jié)合，可能促進(jìn)C13K細(xì)胞表達(dá)MICA，使其與NK細(xì)胞表面NKG2D受體結(jié)合，提高了NK細(xì)胞殺傷活性，從而增加順鉑對卵巢癌細(xì)胞的毒性，這為腫瘤免疫化學(xué)治療提供一定研究基礎(chǔ)，為改善卵巢癌療效帶來了新契機(jī)。而IL-28A通過哪些信號通路及關(guān)鍵分子誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞NKG2D配體表達(dá)，則有待進(jìn)一步證實(shí)。