金志珊，吳江華，馮地路，夏 霖，張青苗，汪宏波

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科;b.血液內(nèi)科，武漢 430022)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染而引起的急性呼吸道傳染病，在我國屬于乙類傳染病，甲類管理，于2020年3月11日由WHO定義為疫情全球大流行。COVID-19為突發(fā)新型冠狀病毒，對其流行病學的了解不夠詳細，現(xiàn)全球疫情肆虐，迫切需要COVID-19年齡及性別流行病學相關(guān)研究[1]。目前年輕女性及妊娠女性的流行病學數(shù)據(jù)尚無明確報道，其免疫狀態(tài)尚不清楚。根據(jù)現(xiàn)有報道[2-3]及華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的26例COVID-19孕婦的預(yù)后分析，COVID-19孕婦均以輕型、普通型居多，重癥病例少見，危重及死亡未見相關(guān)報道[4]，且孕產(chǎn)婦預(yù)后良好。但是，同齡COVID-19感染的未妊娠女性有死亡的相關(guān)報道。女性在妊娠狀態(tài)下，其免疫狀態(tài)不同，感染SARS-CoV-2后的反應(yīng)及預(yù)后亦不同，其免疫功能的變化對COVID-19的治療可能有重要意義。本研究通過檢測COVID-19感染恢復(fù)期的晚期妊娠患者與未妊娠患者外周血中淋巴細胞亞群及細胞因子變化，初步探討了解COVID-19感染合并晚期妊娠患者免疫狀況的變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月30日至4月10日華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的晚期妊娠合并COVID-19感染并成功分娩的患者18例，年齡24～40歲，平均(29.67±4.80)歲;選取同年齡段合并COVID-19感染的未妊娠女性17例，年齡24～41歲，平均(31.2±7.08)歲。兩組患者的排除標準：合并既往血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤疾病;3個月內(nèi)使用過可使血細胞形態(tài)明顯改變藥物。

1.2 相關(guān)定義 核酸檢測轉(zhuǎn)陰時間：患者從發(fā)病開始到檢測到第一次核酸轉(zhuǎn)陰天數(shù)(核酸轉(zhuǎn)陰患者至少在本病區(qū)核酸檢測2次均為陰性，回顧第一次核酸檢測呈陰性時間，如患者入院后核酸已為陰性，無法明確轉(zhuǎn)陰時間，則去除該病例入組核酸轉(zhuǎn)陰時間的統(tǒng)計)。住院天數(shù)：住院當天開始，根據(jù)我國診療指南達到出院標準出院當天為止，且全部晚期妊娠患者均生產(chǎn)后恢復(fù)出院?；謴?fù)期：根據(jù)2020年3月3日國家衛(wèi)生健康委辦公廳發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》試行第7版，患者達到出院標準：(1)體溫恢復(fù)正常3天以上;(2)呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn);(3)肺部影像學顯示急性滲出性病變明顯改善;(4)連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標本核酸檢測陰性(采樣時間至少間隔24h)。實驗組為終止妊娠前達到出院標準，需在恢復(fù)期終止妊娠，采血時間為終止妊娠前;對照組為達到出院標準的未妊娠女性患者，采血時間為出院前。

1.3 儀器及主要試劑 流式細胞儀(BD公司，F(xiàn)ACS Calibur)及CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45RA、CD62L、TCR γδ檢測試劑(流式細胞法-FITC/PE/PerCP/APC)。

1.4 方法 臨床數(shù)據(jù)收集，包括鼻咽拭子核酸，細胞因子六項(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ6)，淋巴細胞亞群分析(比例)。此外，行淋巴細胞絕對值計數(shù)的3組對象均清晨空腹抽取靜脈血2ml，EDTA抗凝。應(yīng)用熒光直接標記法及流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群：CD3+(T淋巴細胞總體比例)，B淋巴細胞(CD19+)，NK細胞(CD3-CD56+)，NKT細胞(CD3+CD56+)，γδ T細胞(TCRγδ+)，中樞記憶性T細胞[CM，EMRA(CD62L-/CD45RA+)];幼稚T細胞(NAIVE，CD62L+/CD45RA+)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0軟件，采用兩組間獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周淋巴細胞亞群比例及細胞因子 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性的病毒轉(zhuǎn)陰天數(shù)和住院天數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。兩組的外周淋巴細胞亞群比例(CD3+總T淋巴細胞、CD4+淋巴細胞、CD8+淋巴細胞、B淋巴細胞、NK淋巴細胞比值、CD4+T/CD8+T)以及細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周淋巴細胞亞群比例及細胞因子測定

2.2 COVID-19未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細胞亞群絕對值對比分析 取3對COVID-19感染未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細胞亞群絕對值對比分析。結(jié)果顯示，晚期妊娠女性的自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)數(shù)顯著低于未妊娠女性(P=0.005)，晚期妊娠女性的自然殺傷T細胞(natural killer T cells,NKT)高于未妊娠女性(P=0.015);兩組的CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及γδT細胞均無統(tǒng)計學差異(圖1)。

圖1 COVID-19未妊娠與晚期妊娠女性恢復(fù)期外周血淋巴細胞亞群絕對值對比分析A：CD3+T細胞;B：CD4+T細胞;C：CD8+T細胞;D：γδ T細胞;E:NK細胞;F:NKT細胞

2.3 COVID-19感染恢復(fù)期未妊娠與晚期妊娠女性外周血淋巴細胞CD4+T及CD8+T細胞亞群絕對計數(shù) 兩組的CD4+T及CD8+T細胞亞群計數(shù)(CM、EM、EMRA、NAIVE)無統(tǒng)計學差異(圖2)。兩組的CD4+及CD8+的亞群比例比較，無統(tǒng)計學差異。

圖2 未妊娠組與晚期妊娠組COVID-19感染恢復(fù)期

3 討 論

妊娠時女性處于一種特殊的免疫耐受狀態(tài)，為了防止妊娠期間的胎兒排斥反應(yīng)，需對胎兒免疫耐受;同時，母體免疫系統(tǒng)保護胎兒免受有害的內(nèi)源性和外源性抗原的影響，包括與病毒和細菌感染有關(guān)的抗原。正常妊娠期，通過抑制T細胞介導(dǎo)的免疫而促進母體環(huán)境對胎兒的維持[5],大多數(shù)細胞因子水平降低，特別是在妊娠最初的20周。妊娠早期外周血CD4+細胞亞群隨著HCG上升而下降，孕10～40+周CD4+細胞逐漸回升[6]。正常妊娠中晚期孕婦與未孕婦女比較，外周血中CD4+T淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞基本不變，NK細胞有一定程度的下降[7]。目前還不清楚這種被抑制的免疫系統(tǒng)是否轉(zhuǎn)化為妊娠期間感染風險的增加。

COVID-19感染者的淋巴細胞比例和數(shù)量減少，尤以CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)顯著減少為主，部分患者炎性細胞因子，如IL-6表達上調(diào)等[8]。本研究顯示，COVID-19感染恢復(fù)期晚期妊娠孕婦與同齡未妊娠女性的T淋巴細胞數(shù)量、比例，CD4、CD8亞型計數(shù)及比例，細胞因子六項比較，均無明顯統(tǒng)計學差異。CD4+T細胞和CD8+T細胞均為異質(zhì)性細胞群，可分為中樞記憶T細胞(CM)，效應(yīng)記憶T細胞(EM)，終末效應(yīng)T細胞(EMRA)，幼稚T細胞(NAIVE)。本研究顯示，CM、EM、EMRA、NAIVE在COVID-19感染后女性中，其變化與妊娠無相關(guān)性。

本研究結(jié)合武漢同濟醫(yī)院[2]及武漢市婦幼保健院[9]的研究，均沒有孕產(chǎn)婦死亡報道，且孕產(chǎn)婦預(yù)后均良好。有專家認為，COVID-19患者病情突然加重，快速出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭可能與“炎癥因子風暴”相關(guān)，患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、G-CSF、IP-10、MCP-1、MIP-1A和TNF-α顯著升高[10]。肺部免疫細胞處于過度活化狀態(tài)，大量免疫細胞的浸潤和組織液的聚集會阻塞肺泡與毛細血管之間的氣體交換，從而導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[11]。妊娠女性呈免疫抑制狀態(tài)，免疫細胞難以過度活化，故而炎癥因子風暴相對弱，ARDS出現(xiàn)情況少見。妊娠時期特殊的免疫狀態(tài)，可能讓妊娠女性處于輕型及普通型，避免了向重型及危重型轉(zhuǎn)變。華中科技大學團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，重癥患者的多種細胞因子僅在某一段時間內(nèi)有顯著上升，而在其他時間段與輕癥組無明顯差異[8]。本研究針對的是恢復(fù)期病例，可能其細胞因子的改變發(fā)生于發(fā)病早期，而恢復(fù)期患者的細胞因子已處于基本正常水平。本研究中單獨恢復(fù)期的兩組間細胞因子的比較無明顯差異，與以上研究相符。

無論對于妊娠或非妊娠女性，盡早了解患者急性期的細胞因子狀態(tài)，及早進行相關(guān)的免疫治療，可能避免輕型和普通型發(fā)展成為重型或危重型。此結(jié)論還需更多的妊娠女性COVID-19急性期相關(guān)研究。本研究進一步結(jié)果顯示，COVID-19感染后恢復(fù)期晚期妊娠與同齡女性比較，T淋巴細胞亞群無明顯差異，NK細胞絕對計數(shù)減少，NKT細胞絕對計數(shù)增加。NK細胞具有細胞毒效應(yīng)，無需抗原預(yù)先致敏就能殺傷靶細胞。COVID-19感染患者較未感染者，NK細胞顯著下降[12]，考慮原因：(1)患者本身存在免疫功能缺陷(孕婦本身NK水平相對低);(2)NK細胞對抗病毒發(fā)生消耗，未能得到及時補充;(3)病毒感染機體后，侵犯免疫系統(tǒng)，破壞NK細胞或抑制NK細胞的生成[12]。隨著研究深入，NK細胞在適應(yīng)性免疫中作用不斷展現(xiàn)，在一定情況下具有抑制病毒特異性T細胞的抗病毒作用。

NKT細胞是一群不同尋常的T淋巴細胞，活化的NKT細胞具有介導(dǎo)天然免疫和特異性免疫應(yīng)答的功能，直接或間接參與機體的免疫應(yīng)答，發(fā)揮殺傷活性。一方面，NKT細胞活化可產(chǎn)生大量細胞因子，參與抗感染;另一方面，可活化其他淋巴細胞，參與抗感染。在病毒性肝炎的研究中，如NKT細胞或CD1d缺失，或者CD1d遞呈脂類抗原缺陷，HBV特異性的T細胞和B細胞應(yīng)答都會消失，病毒清除延遲。且胸腺肽α-1可富集NKT細胞，幫助清除感染病毒的細胞。然而，NKT在COVID-19中的角色不明，未見相關(guān)報道。

以往認為,孕婦抵抗力低，即對病毒的清除能力弱，病程時間較長。本研究中，COVID-19感染晚期妊娠女性與同齡女性的SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)陰時間、住院時間無明顯差異，且住院時間包括晚期妊娠終止妊娠后恢復(fù)的時間。表明妊娠對于COVID-19來說并無劣勢，但孕產(chǎn)婦的心理狀態(tài)是否對病情的恢復(fù)有影響[13]，有待進一步研究。本研究顯示，較COVID-19感染的非妊娠女性，COVID-19感染晚期妊娠NK細胞絕對計數(shù)減少，NKT增加，但其是否改變了對病毒的清除能力，以及COVID-19對子代的影響，尚需進一步探討。目前針對COVID-19無特效藥物，中西醫(yī)均給予免疫調(diào)節(jié)抗病毒藥物[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植改善COVID-2019患者的預(yù)后可能是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15]和促進組織修復(fù)與再生。故針對性免疫治療可進一步了解是否對NK及NKT細胞有調(diào)節(jié)，為后續(xù)治療機制和臨床用藥提供一定的參考。

妊娠合并COVID-19感染的危重癥人數(shù)相對少，可能是因早期發(fā)病時免疫功能抑制而表現(xiàn)為細胞因子風暴弱，故表現(xiàn)為輕癥及普通型較多，危重癥少。妊娠合并COVID-19感染者對病毒的清除能力與同齡女性無明顯差異，是否得益于NK細胞減少的基礎(chǔ)上，繼發(fā)NKT細胞的增加，需后續(xù)進一步研究。本研究僅針對恢復(fù)期患者免疫功能的研究，存在一定的偏差，不能代表急性期免疫應(yīng)答的情況。本研究樣本量少，屬于回顧性研究,且因病例數(shù)限制，未進行不同孕周的淋巴細胞亞群的比較。