鐘黎黎，盛 瑩，郭江虹，陽雙健

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科,衡陽 421001)

子癇前期(preeclampsia,PE)是指在既往血壓正常的情況下，妊娠期20周后出現(xiàn)高血壓，并伴有蛋白尿、其他母體器官(肝、腎臟及神經(jīng)系統(tǒng)等)功能障礙或胎盤功能障礙等新發(fā)病情[1]。PE是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一，全球每年超6萬例孕婦和50萬例胎兒死于PE[1-2]，對孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的身體健康造成嚴(yán)重的威脅。miRNAs參與了人類多種病理生理過程的調(diào)控，對PE的發(fā)生也具有一定的影響，可參與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲過程，調(diào)控缺氧缺血等狀態(tài)[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，miR-198在重度PE患者的胎盤組織中顯著高表達(dá)，并且在缺氧條件下培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-198表達(dá)顯著上調(diào)，但均未闡明其具體作用機(jī)制。miR-198被認(rèn)為是多種癌癥細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制因子，其對非癌細(xì)胞的增殖同樣也具有抑制作用[6]。經(jīng)miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn),miR-198與Wnt2B 3' UTR存在靶向結(jié)合的關(guān)系，而Wnt2是與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因之一[7]。因此，推測miR-198可能參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞獲得侵襲表型的過程，從而與PE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但miR-198在PE中是否通過調(diào)控Wnt2B影響滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為，目前仍不明確。本研究檢測臨床PE患者胎盤組織中miR-198表達(dá)變化，擬通過體外實(shí)驗(yàn)探討miR-198過表達(dá)對人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲的影響，并明確miR-198與Wnt2B在PE中的調(diào)控關(guān)系，以期為臨床治療PE提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2017年1月至2019年1月于南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科確診為PE患者的胎盤組織43例(PE組)，平均年齡(29.4±4.5)歲，平均分娩孕周(36.3±2.2)周。選擇同期行剖宮產(chǎn)分娩的正常妊娠產(chǎn)婦胎盤組織35例作為對照(正常組)，平均年齡(28.7±3.9)歲，平均分娩孕周(37.6±1.5)周。兩組產(chǎn)婦的年齡以及分娩孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及家屬知情同意，并簽署同意書。

1.2 主要試劑和材料 人滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo購自美國模式菌種收集中心(ATCC);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(北京索萊寶生物科技公司);CCK-8試劑盒(日本同仁公司);LipofectamineTM3000(美國Life Technologies公司);miR-198 mimics及其陰性對照mimics NC(廣州銳博生物科技有限公司);Wnt2B過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-Wnt2B)及其空載對照質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);TRIzol(美國Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司);Matrigel膠、Transwell小室(美國BD公司);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);ECL學(xué)發(fā)光試劑、PVDF膜(美國Millipore公司);兔抗人Wnr2B多克隆抗體(ab178418)、兔抗人上皮鈣依賴黏附蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(ab133597)、兔抗人神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(ab245117)、兔抗人人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體(ab137321)、兔抗GAPDH單克隆抗體(ab128915)(英國Abcam公司);辣酸根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(sc-2004)(美國Santa公司);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測胎盤組織中miR-198表達(dá)水平 采用1ml TRIzol裂解100mg組織樣本，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-198上游引物：5'-GAATTCCAGTACTCGGTAGTTGTCTGG-3'，下游引物：5'-GGTACCGCGGTGCTTTTTCCAATCTGC-3';U6上游引物：5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3'，下游引物：5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3'。反應(yīng)條件：94℃變性5s，62℃退火30s，72℃延伸10s，40個(gè)循環(huán)。以U6為miR-198內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-198相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 取出人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)85%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化處理，按3×105細(xì)胞/孔接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到80%融合度時(shí)，按LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-198 mimics及其陰性對照mimics NC和Wnt2B過表達(dá)質(zhì)粒及其空載對照質(zhì)粒分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞，分別記為miR-198 mimics組、mimics NC組、空載組、Wnt2B過表達(dá)組和miR-198 mimics+Wnt2B過表達(dá)組，另選不做任何處理的HTR-8/SVneo細(xì)胞作為對照組。轉(zhuǎn)染48h后，采用qRT-PCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞miR-198及基因表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，采用TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，方法同1.3.1。引物序列：miR-198上游引物：5'-GAATTCCAGTACTCGGTAGTTGTCTGG-3'，下游引物：5'-GGTACCGCGGTGCTTTTTCCAATCTGC-3';U6上游引物：5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3'，下游引物：5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3';Wnt2B上游引物：5'-GCTGGACCAAACCTGAACG-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3';GAPGH上游引物：5'-CCACTCCTCCACCTTTG-3'，下游引物：5'-CACCACCCTGTTGCTGT-3'。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，按2×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，100μl/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，加CCK-8溶液10μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，采用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值(OD)，以O(shè)D450值表示細(xì)胞增殖活性。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，制備單細(xì)胞懸液(1×105細(xì)胞/ml)。取0.3ml細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室中加0.5ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，4%甲醛固定10min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色30min，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)需提前將200μl Matrigel基質(zhì)膠(1mg/ml)平鋪于Transwell小室上室，其他實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48h后收集各組細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以20μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加抗Wnt2B(1∶1000)、抗E-cadherin(1∶2000)、抗N-cadherin(1∶1000)、抗Vimentin(1∶1000)、抗GAPDH(1∶10000)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加二抗(1∶10000)，室溫孵育2h。洗膜后，加ECL學(xué)發(fā)光試劑于暗室中發(fā)光顯影，Image軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 經(jīng)TargetScan Human 7.1分析miR-198和Wnt2B 3' UTR之間的結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成包含Wnt2B 3' UTR野生型(WT)和突變型(MUT)的結(jié)合位點(diǎn)序列片段，分別插入至熒光素酶表達(dá)載體中，構(gòu)建Wnt2B-WT質(zhì)粒和Wnt2B-MUT質(zhì)粒。采用LipofectamineTM3000將miR-198 mimics、mimics NC分別與Wnt2B-WT質(zhì)?；騑nt2B-MUT質(zhì)粒混合后，共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，采用螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-198在PE胎盤組織中表達(dá)升高 與正常組比較，PE組胎盤組織中miR-198相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，見圖1。

圖1 胎盤組織中miR-198表達(dá)水平變化***P<0.001 vs 正常組

2.2 過表達(dá)miR-198對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖活性的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組與mimics NC組細(xì)胞中miR-198表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與mimics NC組比較，miR-198 mimics組細(xì)胞中miR-198表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，表明本實(shí)驗(yàn)成功獲得過表達(dá)miR-198的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo，見圖2A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，mimics NC組細(xì)胞增殖活性無顯著變化(P>0.05);與mimics NC組比較，miR-198 mimics組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.01)，見圖2B。

圖2 轉(zhuǎn)染后HTR-8/SVneo細(xì)胞miR-198表達(dá)和細(xì)胞增殖活性變化A：qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-198表達(dá)水平;B：CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖活性;**P<0.01，***P<0.001 vs 對照組或mimics NC組

2.3 過表達(dá)miR-198對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移與侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，mimics NC組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量無顯著變化(P>0.05);與mimics NC組比較，miR-198 mimics組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)均顯著減少(P<0.001)，見圖3。

圖3 各組細(xì)胞遷移和侵襲情況(結(jié)晶紫染色×200)***P<0.001 vs 對照組或mimics NC組

2.4 過表達(dá)miR-198對HTR-8/SVneo細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，mimics NC組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05);與mimics NC組比較，miR-198 mimic組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 過表達(dá)miR-198對HTR-8/SVneo細(xì)胞中E-cadherin、

2.5 過表達(dá)miR-198對HTR-8/SVneo細(xì)胞中Wnt2B表達(dá)影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，mimics NC組細(xì)胞中Wnt2B mRNA及蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05);與mimics NC組比較，miR-198 mimics組細(xì)胞中Wnt2B mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.001)，見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中Wnt2B mRNA和蛋白表達(dá)水平A：qRT-PCR檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞中Wnt2B mRNA表達(dá);B：Western blot檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞中Wnt2B蛋白表達(dá);***P<0.001 vs 對照組或mimics NC組

2.6 Wnt2B是miR-198靶基因 經(jīng)TargetScan Human 7.1軟件分析，miR-198與Wnt2B 3'UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(圖6B)顯示，與mimics NC組比較，miR-198 mimics可顯著降低Wnt2B-WT質(zhì)粒熒光素酶相對活性(P<0.001)，而miR-198 mimics對Wnt2B-MUT質(zhì)粒熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)，表明Wnt2B是miR-198靶基因。

圖6 miR-198與Wnt2B的靶向調(diào)控關(guān)系A(chǔ)：TargetScan Human 7.1預(yù)測分析miR-198與Wnt2B之間的靶向結(jié)合位點(diǎn);B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-198與Wnt2B之間的靶向關(guān)系;***P<0.001 vs mimics NC組

2.7 過表達(dá)miR-198通過靶向下調(diào)Wnt2B抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖活性 Western blot實(shí)驗(yàn)(圖7A)和CCK-8實(shí)驗(yàn)(圖7B)結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-198 mimic組細(xì)胞中Wnt2B蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.001)，Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞中Wnt2B蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.001)，而空載組細(xì)胞中Wnt2B蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活性無顯著變化(P>0.05);與miR-198 mimic組比較，miR-198 mimic+Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞Wnt2B蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.01);與Wnt2B過表達(dá)組比較，miR-198 mimic+Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞中Wnt2B蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.001)。

圖7 miR-198和Wnt2B共轉(zhuǎn)染對HTR-8/SVneo細(xì)胞中Wnt2B表達(dá)和細(xì)胞增殖活性的影響1：對照組;2：miR-198 mimic組;3：空載組;4：Wnt2B過表達(dá)組;5：miR-198 mimic+Wnt2B過表達(dá)組;***P<0.001 vs 對照組;##P<0.01，###P<0.001 vs miR-198 mimic組;△△△P<0.001 vs Wnt2B過表達(dá)組

2.8 過表達(dá)miR-198通過靶向下調(diào)Wnt2B抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移與侵襲 Transwell結(jié)果(圖8)顯示，與對照組比較，miR-198 mimic組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著減少(P<0.001)，而Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著增多(P<0.001)，而空載組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)無顯著變化(P>0.05);與miR-198 mimic組比較，miR-198 mimic+Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著增多(P<0.001);與Wnt2B過表達(dá)組比較，miR-198 mimic+Wnt2B過表達(dá)組細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)顯著減少(P<0.001)。

圖8 miR-198和Wnt2B共轉(zhuǎn)染對HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲

3 討 論

影響PE形成的因素很多，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，其中包括低氧機(jī)制，由于持續(xù)缺氧導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞向侵襲性表型轉(zhuǎn)變失敗，從而引起螺旋動脈重塑失敗，致使胎盤淺著床[8-9]。Knyazev等[10]認(rèn)為，滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧是影響胎盤正常發(fā)育的重要因素之一，是PE的關(guān)鍵性病理特征。包括缺氧等多種因素會引起多種miRNA表達(dá)異常[11]，它們以信號通路相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，參與免疫系統(tǒng)、血管生成、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲、胎盤形成等多方面的調(diào)控[12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，miR-431在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，通過靶向調(diào)控鋅指E盒結(jié)合同源框1(zinc finger E-box-binding homeobox1,ZEB1)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與侵襲。miR-30b在PE中也呈高表達(dá)，通過靶向MXRA5的MAPK途徑抑制JEG-3和HTR-8/SVneo細(xì)胞的存活與侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而參與PE的形成[14]。miR-198作為一種癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制基因，其在PE中高表達(dá)[4]，可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-198在PE患者胎盤組織中的表達(dá)水平顯著升高，過表達(dá)miR-198抑制了HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在細(xì)胞的遷移與侵襲的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，滋養(yǎng)細(xì)胞通過EMT過程獲得侵襲性和遷移性表型[15]，而在PE中，滋養(yǎng)層EMT存在調(diào)節(jié)障礙[16]。E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin和Vimentin表達(dá)增加是激活EMT的關(guān)鍵性指標(biāo)。Zou等[17]發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路相關(guān)基因可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞EMT和介導(dǎo)Wnt途徑調(diào)控滋養(yǎng)層的遷移與侵襲。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HTR-8/SVneo細(xì)胞的miR-198表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin和Vimentin表達(dá)減少，且靶向負(fù)調(diào)控Wnt2B基因的表達(dá)。提示miR-198通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞EMT抑制細(xì)胞遷移與侵襲，其過程可能通過下調(diào)Wnt2B表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

Wnt信號通路參與了細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲、凋亡等過程，包括經(jīng)典Wnt通路(β-catenin依賴性通路)和非經(jīng)典Wnt通路(β-catenin非依賴性通路)，Wnt1族(包括Wnt1、2、3等)主要參與經(jīng)典Wnt通路，而Wnt5a族(包括Wnt4、5A、5B等)主要參與非經(jīng)典Wnt通路[18]。大量研究[7,17,19]結(jié)果顯示，Wnt1、Wnt2、Wnt3和Wnt5B等Wnt相關(guān)基因均參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與侵襲過程的調(diào)控。饒玉梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-218通過靶向Wnt2B抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲功能。而且Wnt2B在膽管癌細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)與EMT標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)缺失，Vimentin表達(dá)上調(diào)具有相關(guān)性[21]。綜合上述研究報(bào)道，Wnt2B調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與侵襲，可能通過介導(dǎo)EMT發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，miR-198可靶向負(fù)調(diào)控Wnt2B的表達(dá)，上調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞miR-198的表達(dá)，Wnt2B的表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移與侵襲均受到抑制，而當(dāng)上調(diào)Wnt2B表達(dá)后，可緩解miR-198對細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的抑制作用。

綜上所述，miR-198通過靶向Wnt2B抑制滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲。miR-198可能是PE治療的一種潛在生物標(biāo)記物，抑制miR-198表達(dá)有望成為促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移與侵襲性表型獲得的新途徑。