劉素曉，何慧慧，賈 瑞，杜 娟，林珊珊，劉衛(wèi)紅，李 亞

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

肺癌全稱為原發(fā)性支氣管肺癌，起源于支氣管黏膜上皮及肺泡，是導(dǎo)致全球人類死亡的第一大惡性腫瘤，目前多以放射治療、化學(xué)治療及靶向治療為主要手段，但其副作用大，治療費(fèi)用高昂，患者生活質(zhì)量得不到保障[1-2]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)古代經(jīng)典方劑的篩選、挖掘和應(yīng)用還有待深入研究。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤處于輔助治療地位，在增強(qiáng)患者免疫力、減少放射治療和化學(xué)治療的毒副反應(yīng)、提高生活質(zhì)量等方面具有較好的療效和優(yōu)勢(shì)[3-4]。目前，中醫(yī)治療肺癌多以“扶正為本，祛邪為標(biāo)，標(biāo)本兼治”為原則，常用祛邪法有化痰逐瘀、清熱解毒、消積攻堅(jiān)等[5-6]。本團(tuán)隊(duì)通過對(duì)古代典籍的查閱和篩選，發(fā)現(xiàn)《備急千金要方·肺臟積氣》中的系列方劑多與今之治療理念不同，多用溫?zé)崴?、寒熱并用、通補(bǔ)兼施。理肺消積丸正是基于此系列方藥所擬定的方劑，由人參、制烏頭、大黃、紫菀、前胡、細(xì)辛等組成，具有扶正祛邪、消積散結(jié)、攻積逐滯、消痰化痞功效[7]。其臨床療效和相關(guān)作用機(jī)制目前尚不明確，仍需進(jìn)一步深入研究。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因編碼的蛋白兼具脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，是第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因。因此，調(diào)控PTEN蛋白的表達(dá)可作為治療癌癥的途徑之一[8]。本研究以Lewis肺癌小鼠模型為研究對(duì)象，觀察理肺消積丸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和PTEN蛋白等的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

6～8周齡健康的無(wú)特定病原體(specified pathogen free,SPF)級(jí)雄性C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自鄭州市華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2019-0002]，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房[動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(豫)2017-0001]。

1.2 細(xì) 胞

標(biāo)記有熒光素酶的Lewis肺癌細(xì)胞株(Lewis-luciferase,Lewis-luc)由天津市肺癌研究所提供。

1.3 藥品、試劑與儀器

理肺消積丸由人參、制烏頭、大黃、紫菀、前胡、細(xì)辛等組成，由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑實(shí)驗(yàn)室按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒定并制備成小蜜丸，約0.158 g/丸。使用時(shí)與水混懸，按小鼠與人的等效劑量(10丸/d)換算每日小鼠灌胃量。順鉑注射液，齊魯制藥有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)EA1A9004B。DMEM高糖培養(yǎng)基(產(chǎn)品批號(hào)12100-500)、胰蛋白酶(產(chǎn)品批號(hào)T1300)、蘇木素-伊紅染色試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)G1120)，均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)16000-044；熒光素底物，Promega公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)P1041；細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(產(chǎn)品批號(hào)10205-2-AP)、PTEN抗體(產(chǎn)品批號(hào)10047-1-AP)，均為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TUNEL試劑，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)MK1017。IVIS Lumina Series 3型小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，PerkinElmer公司產(chǎn)品；CK40型顯微鏡，奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.4 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、理肺消積丸組、順鉑組和聯(lián)合組5組，每組10只。采用皮下接種法建立肺癌小鼠模型：將培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)100 mL/L胎牛血清)中的Lewis-luc細(xì)胞以胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，用生理鹽水制備為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。除空白對(duì)照外的其余4組均將上述細(xì)胞懸液接種于C57BL/6小鼠右腋部皮下，接種量為0.2 mL/只，接種后將小鼠放回飼養(yǎng)籠繼續(xù)飼養(yǎng)；空白對(duì)照組以相同方法皮下接種生理鹽水。接種1 d 后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行以下干預(yù)。聯(lián)合組：接種Lewis-luc細(xì)胞，給予理肺消積丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射順鉑0.5 μg/(g·d)。理肺消積丸組：給予理肺消積丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射等體積生理鹽水。順鉑組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射順鉑0.5 μg/(g·d)。模型對(duì)照組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射?？瞻讓?duì)照組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射。灌胃及腹腔注射1 d 1次，持續(xù)14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般情況

模型制備后每隔2天固定時(shí)間觀察小鼠皮毛色澤、精神、飲食、活動(dòng)等。

1.5.2 腫瘤生長(zhǎng)情況

末次給藥24 h后，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況。以戊巴比妥鈉50 μg/g體質(zhì)量麻醉小鼠，腹腔注射熒光素底物125 μg/g體質(zhì)量，10 min后，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，拍照，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分光密度值。

1.5.3 腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)情況

取小鼠腫瘤組織，以40 g/L 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，并制備4 μm厚的切片，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變情況。

1.5.4 腫瘤細(xì)胞增殖情況

取小鼠腫瘤組織，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，并制備4 μm厚的切片。采用免疫組化法對(duì)腫瘤組織PCNA蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；顯微鏡下觀察組織陽(yáng)性染色情況，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞占比情況。

1.5.5 腫瘤細(xì)胞凋亡情況

取腫瘤組織，常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟，水合，PBS洗滌，加入TUNEL染色液，封片處理，光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，并拍照。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5.6 腫瘤組織抑癌蛋白PTEN的表達(dá)

采用免疫組化法對(duì)腫瘤組織PTEN蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。操作方法同1.5.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況對(duì)比

空白對(duì)照組小鼠毛色光亮、精神飽滿、飲食充足。模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)毛色晦暗、形體消瘦、精神倦怠、活動(dòng)減少、食量及飲水量減少等表現(xiàn)。各藥物組小鼠皮毛光澤度、活動(dòng)量、飲食量及精神狀態(tài)等有所改善，其中以理肺消積丸組的效果較為明顯。

2.2 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)增強(qiáng)，腫瘤增殖明顯。與模型對(duì)照組對(duì)比，理肺消積丸組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)明顯減弱，腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體內(nèi)熒光信號(hào)積分光密度值對(duì)比

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞排列緊密，呈彌漫分布，異型性明顯，胞漿豐富，核大深染，核分裂象多見。理肺消積丸組、順鉑組及聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則，出現(xiàn)細(xì)胞空泡化、壞死情況，核分裂象減少。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)對(duì)比(HE染色，×200)

2.4 各組小鼠腫瘤細(xì)胞增殖情況對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達(dá)程度高，陽(yáng)性細(xì)胞比例80%以上。與模型對(duì)照組對(duì)比，理肺消積丸組、順鉑組和聯(lián)合組的PCNA蛋白表達(dá)程度均下降，陽(yáng)性細(xì)胞占比明顯降低(P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占比對(duì)比

圖2 各組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達(dá)對(duì)比(免疫組化染色，×200)

2.5 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率低。與模型對(duì)照組對(duì)比，理肺消積丸組、順鉑組和聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表3。

表3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率對(duì)比

圖3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況對(duì)比(TUNEL染色，×200)

2.6 各組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)對(duì)比

模型對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)量極低。與模型對(duì)照組對(duì)比，理肺消積丸組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而順鉑組和聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與理肺消積丸組對(duì)比，順鉑組和聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見圖4和表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占比對(duì)比

圖4 各組小鼠腫瘤組織PTEN蛋白表達(dá)對(duì)比(免疫組化染色，×200)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中并無(wú)肺癌之病名，據(jù)臨床癥狀可將其歸屬于“肺積”“息賁”“息積”“積氣”等范疇。因肺主一身之氣，故將積氣列于肺臟，多因正氣虧損、臟腑失和、氣滯血瘀、飲食痰濁所致。內(nèi)傷七情、飲食不節(jié)等均可導(dǎo)致氣機(jī)失司，釀生痰瘀，熱痰壅結(jié)而生癌毒，膠結(jié)成塊，而成肺積[9-11]。因此，治療應(yīng)以扶正祛邪、清肺消積為主。理肺消積丸方中人參可扶正；制烏頭、大黃一熱一寒，通陽(yáng)散寒；紫菀、前胡降氣止咳，燥濕化痰，消積排膿；細(xì)辛散寒逐飲，止痛鎮(zhèn)咳。全方共奏扶正祛邪、消痰化痞、化癥消積之效，用于治療肺積之證。本研究結(jié)果表明，理肺消積丸可明顯抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，改善肺癌小鼠身體及精神狀況。

腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖及凋亡率的持續(xù)下降是腫瘤快速生長(zhǎng)的細(xì)胞機(jī)制。PCNA為增殖核抗原，存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，通常用來(lái)指示腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，理肺消積丸和順鉑的干預(yù)可明顯降低模型小鼠腫瘤細(xì)胞PCNA的表達(dá)；同時(shí)，理肺消積丸和順鉑可以顯著促進(jìn)模型小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。PTEN是癌癥中最常失活的抑癌基因之一，其在多種癌癥中表達(dá)均降低[13]。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑癌作用[14]。本研究表明，模型對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率極低，理肺消積丸的干預(yù)治療可明顯提高PTEN的表達(dá)水平，而順鉑的干預(yù)并沒有使PTEN的表達(dá)水平得到明顯提高，這可能是由于順鉑通過抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制過程而非提高PTEN蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。

臨床上，采用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療肺癌已經(jīng)成為一種趨勢(shì)，且有相當(dāng)一部分已經(jīng)取得了較好的療效[3]；但中醫(yī)往往處于輔助治療的地位，主要針對(duì)西醫(yī)治療的毒副作用進(jìn)行治療。本研究中，筆者設(shè)計(jì)了理肺消積丸與順鉑的聯(lián)合干預(yù)組，但并沒有觀察到理肺消積丸對(duì)順鉑療效有協(xié)同作用，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的具體原因還尚不清楚，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此結(jié)果提示，臨床中須謹(jǐn)慎或禁止理肺消積丸與順鉑類藥物的聯(lián)合應(yīng)用。

綜上所述，理肺消積丸可顯著抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與其抑制肺癌細(xì)胞增殖、上調(diào)腫瘤細(xì)胞凋亡和PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)，其臨床療效和作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究。