王明月,胡財江*,安孟飛,申 暢,孫澤銳,趙云麗,王宣軍,盛 軍**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 普洱茶教育部重點實驗室,云南 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學 理學院,云南 昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院,云南 昆明 650201;4.云南大學,云南 昆明 650091)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種以骨量減少和骨微結構退變?yōu)樘卣鲝亩率构趋来嘈栽黾?、骨折風險增加的代謝性骨骼疾病[1,2]。由于全球人口老齡化越來越嚴重,OP成為了一種日益普遍的疾病,并成為全世界存在的重大公共衛(wèi)生問題[3,4],尤其是在絕經(jīng)后婦女人群中發(fā)病的概率最大，因為在絕經(jīng)后婦女的雌激素分泌水平下降，這會導致骨量減少，從而增加患骨質(zhì)疏松癥的風險[4-6]。目前我國治療OP的方法主要是藥物法,但它會引發(fā)一系列的副反應,因此日常保健對于OP的治療作用重于服用藥物。鐵皮石斛是一種藥食同源的中草藥,具有極高的藥用價值以及豐富的生理活性,包括降低患胃癌的風險[7]、增強免疫功能[8]、預防肝損傷[9]、抑制腫瘤活性[10]、抗炎[11]等作用,并且其多糖還具有降血糖[12]、降血壓[13]以及具有有效清除自由基從而起到抗氧化活性[14,15]等生理功能。但是迄今有關鐵皮石斛對骨質(zhì)疏松癥的治療效果的報道較少,尤其是對骨微結構方面的影響報道幾乎沒有,鑒于此，筆者探討了鐵皮石斛提取物在改善切除卵巢小鼠的骨微結構方面的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雌性SPF級ICR小鼠,體重在28～30 g,購自成都達碩實驗動物有限公司,許可證號:SYXK(滇)K2013-0004。實驗室溫度在(24±1)℃,相對濕度為50%～60%。

1.2 樣品與儀器

鐵皮石斛莖在2011年收集于云南省,由普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所所長付開聰教授鑒定,并且憑證標本(2011-DPE-1)存于云南農(nóng)業(yè)大學普洱茶學教育部重點實驗室。將石斛莖用打粉機粉碎,在80 ℃條件下溫浸3次,每次1 h,3次的加水量依次為20倍、15倍、15倍。將濾液減壓濃縮(-0.06～-0.08 MPa,50～70 ℃),將相對密度0.90～1.05(60 ℃)的提取物減壓干燥(-0.06～-0.10 MPa,≤70 ℃)至干,粉碎,過80目篩,得深棕色粉末，即鐵皮石斛提取物樣品,其水分含量小于5%。在實驗時取適量的鐵皮石斛提取物樣品，用雙蒸水混懸定容至相應溶度，備用。戊酸雌二醇片,由Bayer公司生產(chǎn)。S1-114電子天平，由北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)。μCT100 Micro-CT，由瑞士SCANCO Medical AG公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及處理

將72只小鼠按照隨機區(qū)組法分為假手術組(Sham組)、模型組(Model組)、雌二醇組(E2組)、鐵皮石斛提取物低劑量組(DCE-Low組)、鐵皮石斛提取物中劑量組(DCE-Medium組)和鐵皮石斛提取物高劑量組(DCE-High組)。在分組后，模型組與處理組均摘除小鼠雙側(cè)卵巢,而假手術組僅切除小鼠兩側(cè)卵巢周圍同樣重量的脂肪組織。術后小鼠恢復1周，然后通過灌胃的方式給予樣品,給予劑量分別為1.50 mg/kg(E2組)、0.35 g/kg(DCE-Low組)、0.70 g/kg(DCE-Medium組)和1.05 g/kg(DCE-High組),連續(xù)灌胃3個月,每周稱重;在解剖前禁食12 h；在解剖后取小鼠左側(cè)股骨進行影像學觀察。

2.2 影像學檢測

通過μCT 100 Micro-CT對骨質(zhì)疏松模型小鼠的左側(cè)股骨進行形態(tài)計量學分析，采集參數(shù)為:分辨率10 μm；曝光時間300 ms；電壓70 kV；電流200 μA。

2.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示。用SPSS 17.0和Graph Pad Prime 5處理實驗數(shù)據(jù)；兩組間的比較使用t-test,P值小于0.05代表有統(tǒng)計學差異。

3 結果與分析

顯微CT分析的結果(圖1)顯示:與假手術組相比,模型組小鼠的骨小梁結構顯著被破壞;而用雌二醇與鐵皮石斛提取物低、中和高劑量分別給骨質(zhì)疏松模型小鼠連續(xù)灌胃3個月后,與模型組相比,E2組(陽性對照組)小鼠的骨小梁結構改善不太明顯,但是鐵皮石斛提取物處理可明顯改善小鼠由于切除卵巢而導致的骨小梁結構損傷的情況。

如圖2所示：與假手術組相比，模型組小鼠的骨密度顯著降低(P<0.05)；而用雌二醇與鐵皮石斛提取物低、中和高劑量分別給骨質(zhì)疏松模型小鼠連續(xù)灌胃3個月后,與模型組相比,E2組以及DCE-High組可明顯改善小鼠由于切除卵巢而導致的骨密度下降的情況(P<0.05或P<0.01)。

如圖3所示：Model組與Sham組相比,骨小梁厚度極顯著降低(P<0.01)；而E2組和DCE-High組與模型組相比，骨小梁厚度顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

如圖4所示：Model組與Sham組相比,骨小梁分離度極顯著增加(P<0.01)；E2組的骨小梁分離度與模型組相比有所增加(P>0.05)；但是DCE低、中、高劑量組與模型組相比，雖然沒有統(tǒng)計學差異，但有降低骨小梁分離度的趨勢(P>0.05)。

由圖5可見：Model組與Sham組相比,骨小梁數(shù)目顯著減少(P<0.05)；E2組與模型組相比，骨小梁數(shù)量略有減少；但是DCE三個劑量組與模型組相比，骨小梁數(shù)量有回升的趨勢(P>0.05)。

從圖6可以看出：Model組與Sham組相比,骨小梁體積比顯著減少(P<0.05);E2組與模型組相比，骨小梁體積比幾乎處在同一水平；但是DCE組與模型組相比，骨小梁體積比有所改善(P>0.05)。這些結果表明用鐵皮石斛提取物處理小鼠可明顯改善切除卵巢導致的骨微結構退變。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥已發(fā)展成為可引起大規(guī)模的臨床和社會經(jīng)濟問題的一種具有全球挑戰(zhàn)性的疾病[16]。前人研究已經(jīng)證明目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物有一定的副作用并且在臨床上受限制[6],因此探索從植物中提取的天然產(chǎn)物來替代藥物的應用具有十分重要的意義。這些替代療法可能表現(xiàn)出更好的活性和更少的副作用。藥用植物鐵皮石斛在以前的研究中就作為一種功能性食品和藥物來使用[17],它主要含有石斛多糖、生物堿、氨基酸、微量元素和菲類化合物等有效成分[18]。之前有學者報道了鐵皮石斛可以治療多種病理疾病，包括免疫、炎癥、癌癥和高血糖[10,19]等,然而到目前為止有關鐵皮石斛在治療骨質(zhì)疏松癥方面的應用報道極少。

行卵巢切除術(OVX)誘導的小鼠是一個被廣泛接受的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實驗模型,它可以模擬雌激素缺乏引起的人類骨丟失。這是一個非常經(jīng)典的動物模型，已被廣泛應用于研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松并且由食品藥品監(jiān)督局推薦[20-22]。骨密度是檢測骨質(zhì)疏松癥骨硬度和骨質(zhì)量的重要指標[23,24];盡管早期研究已經(jīng)證明了由OVX誘導的模型組小鼠與假手術組相比,骨密度會降低[25,26],但是本實驗結果表明用鐵皮石斛提取物處理小鼠可以防止小鼠股骨的骨密度下降。骨小梁體積分數(shù)表示骨組織體積與組織體積的比值,它能直接反映骨量的變化情況,同時也是評價松質(zhì)骨骨量的常用指標之一[27,28]。據(jù)文獻報道,在骨質(zhì)疏松模型小鼠中,模型組的骨小梁體積分數(shù)與假手術組相比明顯減少[29]；本實驗也得到了同樣的結果,但是用鐵皮石斛提取物處理后小鼠的骨小梁體積分數(shù)明顯有所改善。因為骨小梁的骨質(zhì)量與骨微結構緊密相關,因此通過骨小梁的骨微結構可以計算出骨小梁厚度、骨小梁分離度以及骨小梁數(shù)目,這些參數(shù)是評價骨小梁空間形態(tài)結構的主要指標。前人研究表明,在OVX誘導的小鼠中,模型組小鼠與假手術組相比,骨小梁厚度與骨小梁數(shù)量明顯降低，并且骨小梁分離度會增加[30-32]；但是本實驗發(fā)現(xiàn)，用鐵皮石斛提取物處理小鼠可以使這些參數(shù)得到改善。

總的來說,這項研究的結果表明連續(xù)12周灌胃給予小鼠鐵皮石斛提取物可明顯增加骨密度,改善骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結構。本實驗僅從影像學分析了鐵皮石斛對OVX小鼠骨微結構的影響,還需對其可能的作用機制進行進一步研究。