傅馨瑩，孫正驥，吳露，張偉

基于整合藥理學(xué)與時(shí)空效應(yīng)的防治動脈粥樣硬化中藥篩選研究

傅馨瑩1，孫正驥1，吳露2，張偉1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬瀏陽醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300

整合多數(shù)據(jù)庫資源，結(jié)合動脈粥樣硬化（AS）疾病時(shí)空效應(yīng)的特點(diǎn)，針對性篩選有效中藥，以更好地指導(dǎo)臨床合理用藥。通過TCMIP、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取AS及時(shí)空效應(yīng)表型的相關(guān)靶點(diǎn)；基于上述靶點(diǎn)，通過TCMIP數(shù)據(jù)庫“整合藥理學(xué)分析工具集合”的“反向查找中藥”功能，篩選血管內(nèi)皮功能障礙（VED）、血管內(nèi)皮損傷（VEI）、粥樣斑塊形成（PF）3個(gè)時(shí)間階段及骨髓微環(huán)境（BMM）空間過程的防治中藥；通過String、WebGestalt數(shù)據(jù)庫對AS時(shí)空效應(yīng)防治中藥進(jìn)行蛋白互作及GO、KEGG富集分析；通過R語言構(gòu)建弦圖與熱圖，對有效中藥-時(shí)空效應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性、差異性及最佳用藥配伍聚焦。收集AS-VED、AS-VEI、AS-PF、AS-BMM共同靶點(diǎn)分別為924、935、885、1024個(gè)；反向查找中藥結(jié)果顯示，高良姜、漏蘆、葛根、降香等可預(yù)防早期VED，牡荊葉、茜草、高良姜、漏蘆等可治療中期VEI，吳茱萸、急性子、葛根、降香等可消退晚期PF，皂角刺、香加皮、益母草、三棱、瓜蔞等在BMM中發(fā)揮作用，其作用機(jī)制可能與激活Rap1、Hippo、MAPK、Toll-like、TNF、AMPK、PI3K-AKT、NF-κB等多信號通路，調(diào)控AKT1、IL-6、INS、TNF、NR3C1、PPARG、PTGS2等多靶點(diǎn)，以“多藥物-多靶點(diǎn)-多通路”模式在防治AS進(jìn)程中發(fā)揮作用有關(guān)。本研究篩選出針對特異時(shí)間階段與空間過程的中藥，實(shí)現(xiàn)了微觀層次上的辨證論治，為中醫(yī)藥防治AS提供了針對性的中藥及靶點(diǎn)和通路的可能，為中醫(yī)藥輔助干細(xì)胞療法提供思路。

整合藥理學(xué)；動脈粥樣硬化；時(shí)空效應(yīng)；血管內(nèi)皮細(xì)胞；中醫(yī)藥

《中國心血管病報(bào)告2018》顯示，心血管病病死率仍處在首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的43.16%～45.50%，且發(fā)病率持續(xù)上升，在2.9億心血管病患者中有高血壓2.45億、腦卒中1300萬、冠心病1100萬[1]。造成腦卒中與冠心病的前期主要病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），血管病變作為AS的始動因素被研究者廣泛關(guān)注。血管由血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）、平滑肌細(xì)胞（SMCs）、成纖維細(xì)胞構(gòu)成，血管病變主要是各種致病因素作用下VECs功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，局部產(chǎn)生前列環(huán)素、一氧化氮、內(nèi)皮素-1等多種血管活性物質(zhì)，導(dǎo)致血管內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制失常而出現(xiàn)的血管病理性重構(gòu)[2]。

本課題組前期研究顯示，黃芪、當(dāng)歸及其組分配伍可減輕血管壁炎癥，抑制血管病理性重構(gòu)，能較好地防治心腦血管疾病[3-6]。血管內(nèi)皮病變貫穿AS疾病進(jìn)程始終，故提出內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)存在早期血管內(nèi)皮功能障礙（VED）、中期血管內(nèi)皮損傷（VEI）、后期粥樣斑塊形成（PF）時(shí)間階段與骨髓微環(huán)境（BMM）空間過程。時(shí)空效應(yīng)進(jìn)程存在多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑共同作用的特點(diǎn)，在一定程度上與整合藥理學(xué)思想不謀而合。因此，本研究在中醫(yī)整體觀念與辨證論治理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代整合藥理學(xué)思想[7]，分析TCMIP[8]等多數(shù)據(jù)庫資源，根據(jù)AS不同時(shí)間階段與空間過程特點(diǎn)，以靶點(diǎn)為橋梁，針對性篩選有效中藥，以更好地指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 資料與方法

1.1 動脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)與時(shí)空效應(yīng)表型靶點(diǎn)收集

利用TCMIP（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index. php/Home/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）[9]及OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Atherogenesis”“Atherosclerosis”為檢索詞[10-11]，整合3個(gè)數(shù)據(jù)庫結(jié)果以獲得AS疾病靶點(diǎn)。

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，分別以“Vascular Endothelial Dysfunction”“Vascular Endothelial Injury”、“Plaque Formation”為檢索詞[12-14]，以獲得VED、VEI、PF的表型靶點(diǎn)。

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“Mobilization of Bone AND Homing AND Proliferation AND Migration”為檢索式，整合檢索結(jié)果以獲得BMM空間過程[15-18]的表型靶點(diǎn)。

1.2 動脈粥樣硬化-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)整合分析

分別取AS疾病靶點(diǎn)與時(shí)空效應(yīng)表型靶點(diǎn)交集，以獲得AS疾病中VED、VEI、PF階段及BMM過程的“疾病-表型”共同靶點(diǎn)，利用Bioinformatics Gent（http://bioinformatics.psb.ugent.be/beg）中Van de Peer Lab繪制韋恩圖。

1.3 動脈粥樣硬化-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)反向預(yù)測有效中藥及差異篩選

利用TCMIP數(shù)據(jù)庫“整合藥理學(xué)分析工具集合”的“反向查找中藥”功能，設(shè)定子數(shù)據(jù)庫為“中藥”，分別將AS-VED、AS-VEI、AS-PF時(shí)間表型靶點(diǎn)與AS-BMM空間表型靶點(diǎn)導(dǎo)入“自定義基因集”，以獲得干預(yù)AS時(shí)空效應(yīng)的中藥，根據(jù)OR值與值選取前20味中藥為AS時(shí)空效應(yīng)有效中藥。

取AS-VED、AS-VEI、AS-PF 3個(gè)階段有效中藥交集，以篩選AS時(shí)間效應(yīng)的差異中藥，并利用Van de Peer Lab繪制韋恩圖。

1.4 動脈粥樣硬化-時(shí)間效應(yīng)差異中藥作用靶點(diǎn)收集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫[19]，以人體藥代動力學(xué)ADME[20]參數(shù)中口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，獲取AS-時(shí)間效應(yīng)差異中藥有效成分。通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫[21]收集各有效成分SDF結(jié)構(gòu)式。通過Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫[22]，將有效成分SDF結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入，獲取差異中藥作用靶點(diǎn)。

利用String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫[23]，分別導(dǎo)入AS時(shí)間效應(yīng)差異中藥的作用靶點(diǎn)，選擇Multiple Protein，限定物種為“Homo sapiens”，余為默認(rèn)值設(shè)定，以獲得差異中藥作用靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）信息。同時(shí)采用Cytoscape3.7.1軟件對PPI信息進(jìn)行Degree分析并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5 動脈粥樣硬化-時(shí)間效應(yīng)差異中藥的作用靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

利用WebGestalt（http://www.webgestalt.org/#）數(shù)據(jù)庫[24-25]，初步設(shè)定基本參數(shù)，物種為“Homo sapiens”，采用ORA（over-representation analysis）算法分析，選用Funtional Database子數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO、KEGG富集分析。進(jìn)階參數(shù)設(shè)定中，設(shè)定“Significance Level”＜0.05，余為默認(rèn)設(shè)置。收集生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）及KEGG富集分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行加權(quán)集合覆蓋（Weighted set cover）分析，以富集的優(yōu)勢比（OR值）的log2對數(shù)為X軸，以偽發(fā)現(xiàn)率（FDR值）的負(fù)對數(shù)（-lg）為Y軸，繪制火山圖，OR值越大表明富集越顯著，F(xiàn)DR值越小表明富集錯(cuò)誤發(fā)生率越低。

1.6 有效中藥-時(shí)空效應(yīng)的關(guān)聯(lián)性與差異性分析及最佳用藥配伍聚焦

去除80味VED、VEI、PF階段及BMM過程有效中藥的重復(fù)值，以整合時(shí)空效應(yīng)的相同/差異中藥。利用R語言Circlize包與Pheatmap包繪制有效中藥-時(shí)空效應(yīng)弦圖與熱圖。從關(guān)聯(lián)性和差異性角度整合分析有效中藥-時(shí)空效應(yīng)的作用關(guān)系，聚焦AS時(shí)空效應(yīng)中各時(shí)間階段與空間過程的最佳用藥配伍。

2 結(jié)果

2.1 動脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)與時(shí)空效應(yīng)表型靶點(diǎn)

通過TCMIP、GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫，收集AS疾病靶點(diǎn)共1165個(gè)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集得到VED、VEI、PF、BMM時(shí)空效應(yīng)表型靶點(diǎn)，分別為7002、5679、4024、17 606個(gè)。

2.2 動脈粥樣硬化-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)整合分析

利用Bioinformatics Gent取交集分別獲得AS-VED、AS-VEI、AS-PF、AS-BMM共同靶點(diǎn)924、935、885、1024個(gè)，韋恩圖見圖1。

2.3 動脈粥樣硬化-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)有效中藥

根據(jù)上述AS-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)，利用TCMIP數(shù)據(jù)庫“反向查找中藥”功能，獲得AS時(shí)空效應(yīng)80味中藥，前20味有效中藥見表1。

利用Van de Peer Lab獲取AS時(shí)間效應(yīng)的差異中藥，共有中藥16味，AS-VED與AS-VEI差異中藥2味，AS-VED與AS-PF差異中藥2味，AS-VEI差異中藥2味，AS-PF差異中藥2味，韋恩圖見圖2。

圖1 AS-時(shí)空效應(yīng)共同靶點(diǎn)韋恩圖

表1 AS-時(shí)空效應(yīng)前20味有效中藥

序號AS-VED AS-VEI AS-PF AS-BMM 中藥OR值P值 中藥OR值P值 中藥OR值P值 中藥OR值P值 1皂角刺2.588.65E-14 香加皮3.231.58E-13 皂角刺2.618.65E-14 皂角刺3.408.79E-14 2香加皮3.149.11E-13 皂角刺2.552.80E-13 香加皮3.229.11E-13 香加皮2.542.90E-13 3益母草3.261.20E-11 瓜蔞2.142.09E-11 瓜蔞2.201.20E-11 益母草3.534.96E-12 4三棱2.501.32E-11 三棱2.464.08E-11 三棱2.501.32E-11 三棱2.212.96E-11 5瓜蔞2.107.52E-11 益母草3.185.47E-11 娑羅子5.357.52E-11 瓜蔞2.503.70E-11 6娑羅子5.111.01E-10 娑羅子5.139.51E-11 益母草3.201.01E-10 娑羅子5.001.58E-10 7黑豆2.237.12E-10 珠子參2.207.28E-10 藍(lán)布正2.007.12E-10 黑豆2.422.51E-10 8珠子參2.208.44E-10 補(bǔ)骨脂2.092.21E-9 黑豆2.248.44E-10 珠子參2.436.34E-10 9藍(lán)布正1.962.19E-9 苦玄參4.583.63E-9 馬兜鈴2.252.19E-9 藍(lán)布正2.511.79E-9 10竹根七2.282.23E-9 藍(lán)布正1.944.93E-9 苦玄參4.112.23E-9 竹根七2.142.56E-9 11補(bǔ)骨脂2.092.57E-9 黑豆2.175.65E-9 補(bǔ)骨脂2.172.57E-9 補(bǔ)骨脂1.862.63E-9 12苦玄參4.573.85E-9 竹根七2.236.09E-9 珠子參2.173.85E-9 苦玄參3.063.52E-9 13高良姜2.814.22E-9 馬兜鈴2.176.94E-9 三七2.114.22E-9 高良姜2.174.50E-9 14三七2.094.68E-9 三七2.071.15E-8 竹根七2.274.68E-9 三七2.184.61E-9 15葶藶子2.114.90E-9 葶藶子2.081.21E-8 葶藶子2.114.90E-9 葶藶子3.045.68E-9 16降香2.777.26E-9 漏蘆3.001.30E-8 穿山龍3.007.26E-9 降香4.935.78E-9 17馬兜鈴2.157.94E-9 穿山龍2.941.31E-8 急性子2.497.94E-9 馬兜鈴3.326.01E-9 18葛根2.001.20E-8 茜草2.161.48E-8 吳茱萸2.521.20E-8 葛根2.326.86E-9 19漏蘆3.001.41E-8 高良姜2.761.55E-8 葛根2.021.41E-8 漏蘆3.508.20E-9 20穿山龍2.921.43E-8 牡荊葉4.951.96E-8 降香2.791.43E-8 穿山龍1.941.24E-8

圖2 AS-時(shí)間效應(yīng)異同中藥韋恩圖

2.4 動脈粥樣硬化-時(shí)間效應(yīng)差異中藥的作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.7.1軟件對AS-時(shí)間效應(yīng)差異中藥靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。設(shè)定Degree 1～19為粉色，20～29為藍(lán)色，≥30為紅色。

AS-VED與AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）有48個(gè)節(jié)點(diǎn)，260條邊，＜1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度10.8，聚類系數(shù)0.584，其中Degree≥20的靶點(diǎn)為AKT1（Degree＝30）、ALB（Degree＝24）、TNF（Degree＝21）、PPARG（Degree＝21）、NR3C1（Degree＝20）。

AS-VED與AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3B）有71個(gè)節(jié)點(diǎn)，503條邊，＜1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度14.2，聚類系數(shù)0.632，其中Degree≥20的靶點(diǎn)為INS（Degree＝42）、AKT1（Degree＝38）、IL6（Degree＝38）、PPARG（Degree＝25）、NR3C1（Degree＝24）、PTGS2（Degree＝23）、ESR1（Degree＝22）、GASP3（Degree＝21）、IL1B（Degree＝21）、AR（Degree＝20）、TLR4（Degree＝20）。

AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3C）有52個(gè)節(jié)點(diǎn)，253條邊，＜1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度9.73，聚類系數(shù)0.521，其中Degree≥20的靶點(diǎn)為AKT1（Degree＝33）、TNF（Degree＝27）、PTGS2（Degree＝22）、NR3C1（Degree＝21）、CASP3（Degree＝20）、ESR1（Degree＝20）。

AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3D）有54個(gè)節(jié)點(diǎn)，298條邊，＜1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度11，聚類系數(shù)0.618，其中Degree≥20的靶點(diǎn)為INS（Degree＝37）、IL6（Degree＝31）、TNF（Degree＝29）、PPARG（Degree＝25）、TP53（Degree＝25）、PTGS2（Degree＝24）、IL1B（Degree＝23）、NR3C1（Degree＝21）、SREBF1（Degree＝21）、TLR4（Degree＝20）。

注：A. AS-VED與AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)；B. AS-VED與AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)；C. AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)；D. AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)

2.5 動脈粥樣硬化-時(shí)間效應(yīng)差異中藥的作用靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

AS-VED與AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)的BP富集分析了487個(gè)靶點(diǎn)，與198個(gè)生物過程相關(guān)，主要富集于肽絲氨酸修飾、肽基酪氨酸修飾、白細(xì)胞分化等過程。CC富集分析了487個(gè)靶點(diǎn)，與16個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)，主要富集于神經(jīng)元-神經(jīng)元突觸、神經(jīng)元細(xì)胞體，突觸后修飾等組分。MF富集分析了95個(gè)靶點(diǎn)，與10個(gè)分子功能相關(guān)，主要富集于對生物的刺激反應(yīng)、防御反應(yīng)等功能。KEGG富集分析了487個(gè)靶點(diǎn)，與94條信號通路相關(guān)，主要富集于Rap1、Hippo、MAPK、Toll-like、cGMP-PKG等信號通路，結(jié)果見圖4A。

AS-VED與AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)的BP富集分析了71個(gè)靶點(diǎn)，與286個(gè)生物過程相關(guān)，分析主要富集于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)定位、類固醇代謝等過程。CC富集分析了71個(gè)靶點(diǎn)，與3個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)，主要富集于受體復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、膜區(qū)等組分。MF富集分析了71個(gè)靶點(diǎn)，與32個(gè)分子功能相關(guān)，主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、類固醇結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等功能。KEGG富集分析了71個(gè)靶點(diǎn)，與115條信號通路相關(guān)，主要富集于胰島素抵抗及TNF、AMPK、PI3K-AKT等信號通路，結(jié)果見圖4B。

AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)的BP富集分析了52個(gè)靶點(diǎn)，與195個(gè)生物過程相關(guān)，主要富集于類固醇激素反應(yīng)、細(xì)菌起源因子反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等過程。CC富集分析了52個(gè)靶點(diǎn)，與2個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)，主要富集于轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合受體、受體復(fù)合物等組分。MF富集分析了52個(gè)靶點(diǎn)，與17個(gè)分子功能相關(guān)，主要富集于類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、類固醇結(jié)合等功能。KEGG富集分析了52個(gè)靶點(diǎn)，與75條信號通路相關(guān)，主要富集于胰島素抵抗、IL-17、MAPK、Toll-like、cGMP-PKG、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)等信號通路，結(jié)果見圖4C。

AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)的BP富集分析了54個(gè)靶點(diǎn)，與235個(gè)生物過程相關(guān)，主要富集于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)定位等過程。CC富集分析了54個(gè)靶點(diǎn)，與3個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)，主要富集于酶復(fù)合物-含磷基團(tuán)轉(zhuǎn)移、受體復(fù)合體、膜區(qū)等組分。MF富集分析了54個(gè)靶點(diǎn)，與19個(gè)分子功能相關(guān)，主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等功能。KEGG富集分析了54個(gè)靶點(diǎn)，與106條信號通路相關(guān)，主要富集于胰島素抵抗、NF-κB、AMPK、PI3K-AKT、Th17細(xì)胞分化等信號通路，結(jié)果見圖4D。

注：A. AS-VED與AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)；B. AS-VED與AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)；C. AS-VEI差異中藥作用靶點(diǎn)；D. AS-PF差異中藥作用靶點(diǎn)

2.6 有效中藥-時(shí)空效應(yīng)的關(guān)聯(lián)性與差異性分析及最佳用藥配伍聚焦

TCMIP數(shù)據(jù)庫對AS時(shí)空效應(yīng)反向預(yù)測80個(gè)有效中藥，主要聚焦于香加皮、皂角刺、益母草、瓜蔞、三棱、娑羅子、珠子參、黑豆、竹根七、補(bǔ)骨脂、藍(lán)布正、降香、三七、葶藶子、漏蘆、苦玄參、穿山龍、馬兜鈴、高良姜、葛根、急性子、吳茱萸、茜草及牡荊葉。將上述24味有效中藥與AS時(shí)空效應(yīng)構(gòu)建“有效中藥-時(shí)空效應(yīng)”弦圖（見圖5）與熱圖（見圖6）。

注：線條寬度默認(rèn)值為1，中藥線條寬度默認(rèn)值為4

注：黃色為差異中藥，藍(lán)色為共有中藥

3 討論

整合藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)，整合中藥學(xué)、藥理學(xué)、藥代動力學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等多學(xué)科知識，主要采用多維度、多層次的研究方法，具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)特性和整體、動態(tài)的特點(diǎn)[26-27]，實(shí)現(xiàn)了“中藥成分-體內(nèi)代謝-分子網(wǎng)絡(luò)-藥理作用-中醫(yī)理論”多層次可視化的網(wǎng)絡(luò)分析，對中醫(yī)藥與人體相互作用規(guī)律的研究具有重要作用。中藥復(fù)方在人體產(chǎn)生作用的機(jī)制及代謝過程，體現(xiàn)了復(fù)雜的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)特性。因此，基于整合藥理學(xué)研究中醫(yī)理論，可揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用于人體的整體效應(yīng)。

VECs是依附于血管壁緊密排列的單層扁平細(xì)胞，具有屏障、分泌和血管生成的功能，在調(diào)節(jié)血管功能中發(fā)揮重要作用[28-29]。VECs功能障礙與損傷是AS疾病的始動因素與病理基礎(chǔ)[30]。在異常血流剪切力、高血脂、氧自由基等因素作用下，內(nèi)皮細(xì)胞周圍微環(huán)境改變，分泌功能紊亂，一氧化氮、內(nèi)皮素-1、白細(xì)胞介素（IL）等血管活性物質(zhì)分泌異常[31]，VECs出現(xiàn)衰老、凋亡、剝脫的結(jié)構(gòu)損傷，使緊密和黏附連接結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的屏障功能減弱或喪失，血管壁通透性增加，內(nèi)膜完整性受到破壞，從而使炎性因子、血小板黏附因子、單核細(xì)胞及脂質(zhì)等向VECs下遷移與沉積，最終導(dǎo)致PF。因此，VED、VEI、PF是AS病理過程中的3個(gè)時(shí)間階段。生理?xiàng)l件下，由內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）介導(dǎo)的修復(fù)代償機(jī)制與VECs介導(dǎo)的病理損傷過程存在著動態(tài)平衡[32-33]，EPCs存在于骨髓、胚胎細(xì)胞臍帶血中，VECs損傷后，EPCs經(jīng)歷動員（募集到外周血）、歸巢（黏附整合到損傷部位）、增殖及分化（增殖、分化為VECs）等環(huán)節(jié)，從空間層次上對AS病理過程進(jìn)行自我修復(fù)[34]。因此，尋找特異性修復(fù)3個(gè)時(shí)間階段及促進(jìn)EPCs修復(fù)血管的空間過程的藥物，可達(dá)到更高效修復(fù)血管病變的目的，為中醫(yī)藥輔助干細(xì)胞療法提供思路。

本研究通過TCMIP數(shù)據(jù)庫，以疾病和表型相關(guān)靶點(diǎn)為橋梁，反向預(yù)測具有特異修復(fù)AS時(shí)空效應(yīng)的中藥共80味，其中時(shí)間效應(yīng)60味，整合后為24味，空間效應(yīng)20味。結(jié)果顯示高良姜、漏蘆、葛根、降香等中藥可預(yù)防早期VED，牡荊葉、茜草、高良姜、漏蘆等中藥可治療中期VEI，吳茱萸、急性子、葛根、降香等可消退晚期PF，皂角刺、香加皮、益母草、三棱、瓜蔞等在BMM中發(fā)揮作用。研究表明，高良姜的主要有效成分高良姜素能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF），在血管新生中起作用；也能激活NF-κB/ERK通路調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6因子，介導(dǎo)血管氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[35-36]。葛根的主要有效成分葛根素與梓醇配伍可通過激活ERK/PI3K-AKT/mTOR信號通路，上調(diào)HIF-1α，抗VECs凋亡，促進(jìn)血管新生及修復(fù)和EPCs歸巢[37]。茜草炭可增強(qiáng)VECs活性，降低ox-LDL對VECs的損傷[38]。吳茱萸有效成分吳茱萸次堿通過激活辣椒素受體促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的合成與釋放，與VECs中的CGRP受體結(jié)合以促進(jìn)VECs增殖，抑制其凋亡，修復(fù)VEI[39]。因此，在AS時(shí)空效應(yīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)程中，針對各時(shí)間階段及空間過程合理選用中藥，可更大程度改善各病理階段的血管病變，促進(jìn)EPCs遷移過程，更好地防治AS。

本研究基于時(shí)空效應(yīng)差異中藥，進(jìn)一步探討中醫(yī)藥防治AS的可能作用機(jī)制，PPI網(wǎng)絡(luò)及GO、KEGG富集分析結(jié)果表明，AS時(shí)空效應(yīng)過程受到多靶點(diǎn)相互作用、多信號通路共同介導(dǎo)，具有多靶點(diǎn)-多通路特點(diǎn)，但是存在偏重效應(yīng)。其中，多靶點(diǎn)主要涉及AKT、TNF、ALB、NR3C1、IL1B、GASP3等，多通路主要與TNF、PI3K-AKT、VEGF信號通路的多步驟連續(xù)調(diào)控有關(guān)，在時(shí)空效應(yīng)層面上具有偏重效應(yīng)，如AKT1在VED-VEI轉(zhuǎn)化階段Degree為30，在VED-PF轉(zhuǎn)化階段為38，在VEI階段為33，在PF階段未見AKT1分子相互作用，因此AKT1可能主要參與VEI、VED階段，在轉(zhuǎn)化階段可能起到重要調(diào)控作用，在PF階段作用可能不顯著。此預(yù)測結(jié)果可作為中醫(yī)藥防治AS的新思路，為后續(xù)研究提供參考。

AKT分子是PI3K-AKT信號通路中重要的下游靶激酶，磷酸化的AKT通過介導(dǎo)SMCs遷移、血小板活化、白細(xì)胞黏附等，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示，在AS疾病進(jìn)程中，氧化應(yīng)激、炎癥因子及ox-LDL可導(dǎo)致PI3K和磷酸化的AKT失活，通過上調(diào)凋亡基因Bax、Bak表達(dá)，使線粒體膜上形成通道并與之結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞色素穿過線粒體膜進(jìn)入胞質(zhì)，導(dǎo)致VECs凋亡、脫落，增加血管內(nèi)膜通透性[40-41]。TNF-α可直接損傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)VECs表面黏附分子異常表達(dá)，促進(jìn)穿孔蛋白在VECs表面形成膜間通道，使B粒酶進(jìn)入胞內(nèi)，激活Caspases相關(guān)蛋白活性，破壞VECs結(jié)構(gòu)及DNA斷裂，引起VECs死亡、脫落，血管內(nèi)膜通透性增加，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞、血小板黏附于內(nèi)皮表面，SMCs增殖，脂質(zhì)向內(nèi)膜下沉積，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)分化成泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜增厚，斑塊形成，從而導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展。研究表明，EPCs能對AS損傷VECs進(jìn)行自我修復(fù)，主要通過激活VEGF信號通路，促進(jìn)EPCs動員、歸巢、增殖、分化為VECs。VEGF是骨髓動員的重要因子，VEGF可上調(diào)SDF-1與CXCR4，激活PI3K和AKT，促進(jìn)eNOS磷酸化，釋放一氧化氮，同時(shí)VEGF與EPCs表面的VEGFR2受體結(jié)合，促進(jìn)EPCs動員進(jìn)入外周血[42]。內(nèi)膜受損部位VECs釋放VEGF等趨化因子與進(jìn)入外周血的EPCs結(jié)合，促進(jìn)EPCs歸巢，增殖分化為VECs參與血管內(nèi)膜修復(fù)。因此，多靶點(diǎn)、多通路貫穿AS時(shí)空效應(yīng)始終，綜合發(fā)揮調(diào)控作用，為靶向防治策略提供了理論依據(jù)，為中醫(yī)藥多靶點(diǎn)防治提供了可能。

本研究進(jìn)一步對有效中藥-時(shí)空效應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)與差異性聚焦分析，得出24味中藥與時(shí)空效應(yīng)各階段的對應(yīng)關(guān)系，同時(shí)整合中藥作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)和KEGG富集分析可得出高良姜、葛根、茜草、吳茱萸等各時(shí)空效應(yīng)相關(guān)中藥可能是通過激活Rap1、Hippo、MAPK、Toll-like、TNF、AMPK、PI3K-AKT、NF-κB等多信號通路，調(diào)控AKT1、IL-6、INS、TNF、NR3C1、PPARG、PTGS2等多靶點(diǎn)，以“多藥物-多靶點(diǎn)-多通路”模式在防治AS進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究基于整合藥理學(xué)分析AS時(shí)間效應(yīng)3個(gè)階段與空間效應(yīng)中BMM的靶點(diǎn)，通過TCMIP數(shù)據(jù)庫反向預(yù)測修復(fù)3個(gè)階段及促進(jìn)EPCs修復(fù)血管的空間過程的藥物，與益氣活血中藥黃芪-當(dāng)歸配伍，根據(jù)疾病不同階段特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)辨證論治，為中醫(yī)藥防治AS時(shí)空效應(yīng)的靶點(diǎn)和通路提供依據(jù)。

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Study on Screening of TCM Prevention and Treatment of Atherosclerosis Based on Integrative Pharmacology and Spatiotemporal Effects

FU Xinying1, SUN Zhengji1, WU Lu2, ZHANG Wei1

To integrate multi-database resources to select effective Chinese materia medica combined with the characteristics of spatiotemporal effect of atherosclerosis (AS); To better guide the rational medication in clinic.The related targets of atherosclerosis and “spatiotemporal effect” phenotype were obtained by TCMIP, GeneCards and OMIM database, and TCM prevention and treatment of “time effect” of vascular endothelial dysfunction (VED), vascular endothelial injury (VEI), plaque formation (PF) and “space effect” of bone marrow microenvironment (BMM) were screened through the function of “reverse search for Chinese materia medica” in the collection of integrated pharmacological analysis tools in TCMIP database. The enrichment analysis of PPI, GO and KEGG was carried out on TCM prevention and treatment for spatiotemporal effect of AS through String and WebGestalt database; chord map and heat map were constructed by R language to focus on the correlation and difference of “effective Chinese materia medica spatiotemporal” and the best compatibility of medicine.The common targets of AS-VED, AS-VEI, AS-PF and AS-BMM were 924, 935, 885 and 1024 respectively. The results of reverse search of Chinese materia medica showed that Alpiniae Officinarum Rhizoma, Rhapontici Radix, Puerariae Lobatue Radix, and Dalbergiae Odoriferae Lignum could prevent vascular endothelial dysfunction in the early stage; Viticis Negundo Folium, Rubiae Radix et Rhizoma, Alpiniae Officinarum Rhizoma, Rhapontici Radix could treat vascular endothelial injury in the middle stage; Euodiae Fructus, Impatientis Semen, Puerariae Lobatue Radix, and Dalbergiae Odoriferae Lignum could eliminate atherosclerotic plaque in the advanced stage, and Chinese materia medica such as Gleditsiae Spina, Periplocae Cortex, Leonuri Herba, Sparganii Rhizoma, and Trichosanthis Fructus could play a role in bone marrow microenvironment, and their mechanism may be related to activating Rap1, Hippo, MAPK, Toll-like, TNF, AMPK, PI3K-AKT, NF-κB signal pathway and regulating multiple targets such as AKT1, IL-6, INS, TNF, NR3C1, PPARG, PTGS2, etc. The “multi-drug-multi-target-multi-pathway” model could play a more important role in the prevention and treatment of AS.The Chinese materia medica with specific time stages and spatial processes screened out in this study realize the differentiation and treatment at the micro level, provide targeted Chinese materia medica and the possibility of targets and pathways for TCM prevention and treatment of AS, and provide ideas for TCM to assist stem cell therapy.

integrated pharmacology; atherosclerosis; spatiotemporal effect; vascular endothelial cells; TCM

R271.917.41；R285.5

A

1005-5304(2021)04-0032-09

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003451

國家自然科學(xué)基金（81774032）；湖南省自然科學(xué)基金杰出青年基金（2020JJ2024）；湖南省自然科學(xué)基金青年基金（2018JJ3391）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（19A374）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生培養(yǎng)質(zhì)量工程專項(xiàng)（2020CX62）

張偉，E-mail：zeen6463@sina.com

（收稿日期：2020-03-16）

（修回日期：2020-04-18；編輯：季巍?。?/p>