李丹陽(yáng)，黃霖霄，楊 毅

(1 海南大學(xué)，海口，570228；2 貴州大學(xué)，貴陽(yáng)，550025；3 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海口，571101；4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？冢?71101)

瓊中綠橙前身是紅江橙(Citrussinensis‘Hongjiangcheng’)，于1988年從廣東廉江引入海南省瓊中黎族苗族自治縣進(jìn)行種植。經(jīng)過(guò)在瓊中山區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境下長(zhǎng)期馴化選育，瓊中綠橙成為了海南有濃郁山區(qū)特色的名優(yōu)水果[1]，2008年3月瓊中綠橙成為海南省地理標(biāo)志性產(chǎn)品。瓊中綠橙經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，種植規(guī)模逐年增大，同時(shí)柑桔黃龍病的防控形勢(shì)也日益嚴(yán)峻。柑桔黃龍病是一種全球性、毀滅性、檢疫性病害[2-3]，患病果樹(shù)的葉片、果實(shí)癥狀明顯，病癥因品種不同而存在差異[4-6]?；疾」麡?shù)出現(xiàn)落果嚴(yán)重，產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)死亡[7]，果實(shí)品質(zhì)顯著下降，果實(shí)小、畸形、果皮粗厚、果肉少，口感變差，酸度、異味度明顯，維生素C等營(yíng)養(yǎng)成分含量降低[8-9]。柑桔黃龍病由韌皮部桿菌“CandidatusLiberibacter spp.”引起，在我國(guó)主要致病菌為亞洲種“CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas”[10-12]。自然條件下，柑桔黃龍病主要以柑桔木虱作為傳毒昆蟲(chóng)介體進(jìn)行傳播[13-15]；帶病苗木或接穗的流通，可造成遠(yuǎn)距離傳播[16-17]。目前關(guān)于黃龍病菌濃度與果實(shí)品質(zhì)關(guān)系的定量研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以感染柑桔黃龍病菌的瓊中綠橙為材料，通過(guò)熒光定量PCR方法分析黃龍病菌濃度對(duì)果實(shí)內(nèi)外品質(zhì)的影響，研究結(jié)果為評(píng)價(jià)黃龍病對(duì)瓊中綠橙果實(shí)品質(zhì)的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料瓊中綠橙果實(shí)于2019年12月采自海南省瓊中縣。采樣果園管理栽培措施及環(huán)境條件基本一致，樹(shù)齡14年。果實(shí)采自有黃龍病典型癥狀的植株，一共采摘5株樹(shù)，將每株樹(shù)上選定枝條上的所有果實(shí)全部采摘。每株樹(shù)隨機(jī)選出大小不同的10個(gè)果實(shí)，一共50個(gè)果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)(圖1)。

1.2 方法

1.2.1 黃龍病菌濃度檢測(cè) 稱(chēng)取200 mg新鮮果實(shí)的中心柱，剪碎，采用植物DNA提取試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取中心柱總DNA。采用黃龍病菌亞洲種16S rDNA特異性引物HLBas(5’-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3’)和HLBr(5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’)，熒光探針HLBp(5’-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’)，柑桔中保守的植物細(xì)胞色素氧化酶序列的特異性引物COXf(5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’)和COXr(5’-GCCAAAA CTGCTAAGGGCATTC-3’)，COXp(5’-ATCCAGATGCTTACGCTGG-3’)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以判定果實(shí)中黃龍病病菌濃度[18]。

圖1 部分供試瓊中綠橙黃龍病樹(shù)、病枝和病果

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算公式為：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt校準(zhǔn)品；2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量[19]。本試驗(yàn)中進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)所選用的校準(zhǔn)品來(lái)自50個(gè)樣品，選用其中ΔCt為中間值的樣品作為校準(zhǔn)品，相對(duì)應(yīng)的-ΔΔCt=ΔCt校準(zhǔn)品-ΔCt校準(zhǔn)品=0，相對(duì)應(yīng)的病菌濃度的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct=1。

1.2.2 外觀及內(nèi)在品質(zhì)測(cè)定 用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)縱徑和橫徑，電子天平稱(chēng)單果質(zhì)量、果皮質(zhì)量、殘?jiān)|(zhì)量和種子質(zhì)量，用糖酸折射儀測(cè)定果汁可溶性固形物、可滴定酸含量。相關(guān)計(jì)算公式如下：可食率(%)=[(單果質(zhì)量-果皮質(zhì)量-種子質(zhì)量)/單果質(zhì)量]×100，果汁率(%)=[(單果質(zhì)量-果皮質(zhì)量-殘?jiān)|(zhì)量)/單果質(zhì)量]×100，種子率(%)=(種子質(zhì)量/單果質(zhì)量)×100，果皮率(%)=(果皮質(zhì)量/單果質(zhì)量)×100，固酸比=可溶性固形物/可滴定酸，果形指數(shù)=縱徑/橫徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用SAS軟件求得果實(shí)品質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)與病菌濃度(相對(duì)表達(dá)量)的線性回歸方程；樣品按病菌濃度(相對(duì)表達(dá)量)分組后，應(yīng)用SAS軟件Duncan方法進(jìn)行方差分析(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)外觀品質(zhì)受到的影響

供試果實(shí)的病菌濃度(指相對(duì)表達(dá)量，下同)范圍在0～12.55之間，果實(shí)縱徑在64.97～57.44 mm之間，果實(shí)縱徑(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -0.581 6x+ 63.431，R2= 0.163 8，p=0.004<0.05)。病菌濃度>8.00的果實(shí)縱徑均值比健康果實(shí)小11.59%，差異顯著(p<0.05)(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的橫徑在67.35～59.05 mm之間，果實(shí)橫徑(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -0.483 9x+ 65.667，R2=0.114 6，p=0.016<0.05)。不同病菌濃度組間橫徑無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的果形指數(shù)在0.83～0.94之間，果形指數(shù)(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(y= 0.005 4x+ 0.848 2，R2= 0.094 8，p=0.030<0.05)。病菌濃度4.00～8.00的果實(shí)果形指數(shù)均值比健康果實(shí)大13.25%，差異顯著(p<0.05)(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的單果質(zhì)量在166.35～109.66 g之間，單果質(zhì)量(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -3.525 3x+ 153.45，R2= 0.145 2 ，p=0.006<0.05)。病菌濃度>4.00的果實(shí)單果質(zhì)量顯著(p<0.05)小于健康果實(shí)(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的果皮率在20.33%～19.51%之間，果皮率(y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= 0.000 1x+ 0.197 7，R2= 0.000 3，p=0.908>0.05)。不同病菌濃度組間果皮率無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的殘?jiān)试?0.42%～22.90%之間，殘?jiān)?y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= 0.001 8x+ 0.210 4，R2= 0.075 ，p=0.054>0.05)。不同病菌濃度組間殘?jiān)薀o(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的種子數(shù)量在19.00～12.67粒之間，種子數(shù)量(y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= -0.212 5x+ 17.923，R2=0.028 3，p=0.243>0.05)。不同病菌濃度組間種子數(shù)量無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的種子質(zhì)量在2.69～1.43 g之間，種子質(zhì)量(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -0.094 2x+ 2.708 2，R2= 0.127 9 ，p=0.011<0.05)。不同病菌濃度組間種子質(zhì)量無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

2.2 果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)受到的影響

供試果實(shí)的果汁率在57.74%～56.47%之間，果汁率(y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= -0.001 5x+ 0.573 8，R2= 0.027 2，p=0.236>0.05)。不同病菌濃度組間果汁率無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的可食率在78.17%～79.04%之間，可食率(y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= 0.000 2x+ 0.785 1，R2= 0.000 7 ，p=0.847>0.05)。不同病菌濃度組間可食率無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的可溶性固形物含量在9.78%～8.19%之間，可溶性固形物含量(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -0.163 7x+ 9.899 7，R2= 0.288 1，p=0.000<0.05)。病菌濃度>8.00的果實(shí)可溶性固形物含量相對(duì)健康果實(shí)減少15.13%，差異顯著(p<0.05)(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的可滴定酸含量在0.60%～0.66%之間，可滴定酸含量(y)隨著病菌濃度(x)增加無(wú)明顯變化(y= 0.008 3x+ 0.590 9，R2= 0.068，p=0.067>0.05)。不同病菌濃度組間可滴定酸含量無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

供試果實(shí)的固酸比在17.09～12.85之間，固酸比(y)隨著病菌濃度(x)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(y= -0.484 2x+ 17.46，R2= 0.215 3，p=0.001<0.05)。不同病菌濃度組間果實(shí)固酸比無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

表1 黃龍病菌濃度對(duì)瓊中綠橙果實(shí)內(nèi)外品質(zhì)指標(biāo)的影響

3 討論與結(jié)論

果實(shí)外觀是果實(shí)的重要商品屬性，一定程度上影響著果實(shí)的市場(chǎng)價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度黃龍病菌能夠影響瓊中綠橙果實(shí)外在品質(zhì)。隨著病菌濃度的增加，果形指數(shù)變大，果實(shí)縱經(jīng)、果實(shí)橫徑、單果質(zhì)量、種子質(zhì)量變小，果皮率、殘?jiān)屎头N子數(shù)量變化不明顯。果實(shí)按一定病菌濃度分組后進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，病菌濃度(相對(duì)表達(dá)量)>8.00的果實(shí)縱經(jīng)顯著小于健康果實(shí)；病菌濃度(相對(duì)表達(dá)量)4.00～8.00的果實(shí)的果形指數(shù)顯著大于健康果實(shí)，單果質(zhì)量顯著小于健康果實(shí)。王飛燕等[20]報(bào)道，黃龍病會(huì)使沙田柚出現(xiàn)單果質(zhì)量下降、果皮變薄、種子敗育增多等現(xiàn)象，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。韋欣等[21]報(bào)道，黃龍病會(huì)使紐荷爾臍橙果形指數(shù)顯著變小，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能與柑桔品種不同有關(guān)。綜上所述，黃龍病對(duì)柑桔果實(shí)外在品質(zhì)有顯著影響，果實(shí)受黃龍病影響程度與感染病菌濃度存在相關(guān)性。

柑桔的內(nèi)在品質(zhì)是衡量果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著病菌濃度的增多，瓊中綠橙果實(shí)的果汁率、可食率、可滴定酸含量無(wú)明顯變化，可溶性固形物含量和固酸比降低。果實(shí)按一定病菌濃度分組后進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，病菌濃度>8.00的果實(shí)可溶性固形物含量顯著低于健康果實(shí)。吳豐年等[22]報(bào)道，高黃龍病菌濃度(Ct<26)的沙田柚可食率、出汁率、可溶性固形物含量顯著下降。王圣通等[23]報(bào)道，黃龍病會(huì)使蕉柑果實(shí)可溶性固形物變小、可滴定酸含量變大、固酸比變小等現(xiàn)象。這與本試驗(yàn)結(jié)果既有一致的地方，也有不一致的地方，可能是試驗(yàn)所用柑桔品種不同所致。陸英等[24]報(bào)道，黃龍病會(huì)使瓊中綠橙果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)下降，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。分析認(rèn)為，感染黃龍病后的植株韌皮部壞死，篩管堵塞[25]，嚴(yán)重影響光合作用產(chǎn)物的移動(dòng)，導(dǎo)致葉片中淀粉積累，葉片出現(xiàn)斑駁黃化，葉片的斑駁黃化又進(jìn)一步影響光合作用，因此，最后會(huì)導(dǎo)致果實(shí)可溶性固形物含量明顯下降。綜上所述，黃龍病對(duì)柑桔果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)影響顯著，果實(shí)受黃龍病影響程度和受感染病菌濃度存在相關(guān)性。

此外，在本試驗(yàn)所選取的50個(gè)綠橙果實(shí)中，大部分果實(shí)的黃龍病菌濃度偏低，接近健康果實(shí)，所測(cè)定的內(nèi)在品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)也都存在一個(gè)穩(wěn)定的范圍。本研究還發(fā)現(xiàn)，同一株樹(shù)上綠橙果實(shí)內(nèi)的黃龍病菌含量大致接近，不同株間果實(shí)黃龍病菌含量存在明顯差異。黃龍病菌濃度對(duì)果實(shí)維生素C、類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素等的影響有待進(jìn)一步研究。