馬春芳,李 敏,張 雯,吳春燕,陳建蓉,鄧亞婷,王 旗,余永濤,楊 奇*

(1.寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750011；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021)

磷酸替米考星可溶性粉為磷酸替米考星和無水葡萄糖或乳糖配制而成，有效成分為替米考星，屬大環(huán)內(nèi)酯類，畜禽專用廣譜抗菌藥物[1]，對(duì)革蘭氏陽性菌和一些革蘭氏陰性菌及支原體等有很強(qiáng)的抑菌作用[2-3]，主要用于治療敏感性細(xì)菌引起的消化道、呼吸道疾病[4-5]?，F(xiàn)行《中國獸藥典》(2015版)[6]對(duì)替米考星、替米考星注射液、替米考星預(yù)混劑、替米考星溶液等劑型做了詳細(xì)規(guī)定，將高效液相色譜法規(guī)定為替米考星含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但不同劑型在樣品制備和流動(dòng)相配制上，存在一定的差異。美國獸藥典(USP)中收錄了替米考星、替米考星注射液的HPLC測定方法，與《中國獸藥典》(2015版)中替米考星含量測定方法色譜條件略有不同。現(xiàn)行《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017版)[7]對(duì)替米考星可溶性粉做了詳細(xì)規(guī)定，其含量測定方法與現(xiàn)行《中國獸藥典》(2015版)中規(guī)定的替米考星含量測定方法一致。但上述藥典和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均未收載磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅農(nóng)業(yè)部2172號(hào)[8]、2270號(hào)[9]、2440號(hào)[10]、2455號(hào)公告[11]對(duì)磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其檢測方法作了規(guī)定。4個(gè)公告均采用高效液相色譜法作為檢測方法，均規(guī)定磷酸替米考星按替米考星含量計(jì)，含量應(yīng)為標(biāo)示量的90.0 %～110.0 %。但4個(gè)公告中含量測定流動(dòng)相的比例、供試品及對(duì)照品處理方法均不一致，存在檢測方法不準(zhǔn)確，專屬性不強(qiáng)等問題。根據(jù)中國獸藥典委員會(huì)提出的磷酸替米考星可溶性粉中替米考星檢測方法修訂的要求，本研究參考《美國獸藥典》[12]中替米考星檢測標(biāo)準(zhǔn)和《中國獸藥典》(2015版)中替米考星檢測標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合4個(gè)公告中收載的磷酸替米考星可溶性粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及國內(nèi)其他劑型中替米考星含量測定的研究[13]，對(duì)HPLC法測定磷酸替米考星可溶性粉中替米考星的含量進(jìn)行研究及方法學(xué)驗(yàn)證，以期為磷酸替米考星可溶性粉含量檢測方法的修訂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量95.3 %，批號(hào)K0311805；磷酸替米考星可溶性粉，規(guī)格10%，山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司，批號(hào)1803001、1803002、1803003；廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司保健品廠，批號(hào)20180101、20180102、20180103；寧夏泰瑞制藥股份有限公司，批號(hào)F83190503；河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)18012301、18012302、1802303。

乙腈，購自Fishow chemical，批號(hào)為172290，色譜級(jí)；磷酸，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170216，優(yōu)級(jí)純；四氫呋喃，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20180206，色譜級(jí)；正二丁胺，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20180303，化學(xué)純；超純水由德國默克密理博儀器現(xiàn)制。

1.2 儀器 Agilent1100(配備紫外檢測器)、Agilent1260 Ⅱ高效液相色譜儀(配備紫外檢測器)，購于美國Agilent公司；電子天平(十萬分之一)和FE28-pH計(jì)，購于德國梅特勒-托利多公司；KQ-250B型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；ZB8/AKF-3水分測定儀，購于瑞士萬通公司；DZF-6090減壓干燥箱，購于上海旌派科技有限公司。

1.3 含量測定方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 磷酸二丁胺緩沖液 用移液管量取磷酸1 mL，用超純水稀釋至10 mL制成磷酸溶液；取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，邊加邊攪拌，冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1，加超純水至100 mL，搖勻即得。

1.3.1.2 12.5 mol/L氫氧化鈉溶液 稱取氫氧化鈉50 g，加少量超純水快速攪拌使溶解，放置冷卻后用超純水稀釋定容至100 mL，搖勻，即得。

1.3.1.3 稀釋液的配制 量取超純水900 mL，加入磷酸5.71 g，用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1，加超純水至1000 mL，搖勻，即得。

1.3.1.4 流動(dòng)相的制備 以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動(dòng)相，調(diào)pH值2.5±0.1。

1.3.1.5 儲(chǔ)備溶液的制備 稱取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品26.23 mg于25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，備用。

1.3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品26.23 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲使溶解，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.1.7 供試品溶液的制備 精密稱取磷酸替米考星可溶性粉適量(約相當(dāng)于替米考星25 mg)，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲溶解，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3.2 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相；檢測波長為280 nm；替米考星含量測定流速為1.0 mL/min；理論塔板數(shù)按替米考星順式異構(gòu)體峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)符合要求。

1.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密稱取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置50 mL容量瓶中，加乙腈10 mL，超聲使溶解，再用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。

1.3.4 專屬性考察 將配置好的替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、溶劑空白、輔料空白(磷酸溶液、無水葡萄糖、乳糖)，按含量測定項(xiàng)下方法精密量取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖,按外標(biāo)法以替米考星峰面積計(jì)算。

1.3.5 線性考察 取替米考星對(duì)照品52.47 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加乙腈10 mL溶解，加磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液2、4、5、6、8 mL于10 mL的容量瓶中，分別用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL的溶液。取以上每個(gè)濃度的溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以替米考星(順式+反式)峰面積與對(duì)照品濃度做回歸曲線。

1.3.6 定量限和檢測限 將替米考星儲(chǔ)備液逐步稀釋，配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定相應(yīng)信噪比，以信噪比3∶1時(shí)的濃度為檢測限，信噪比10∶1時(shí)的濃度為定量限。

1.3.7 精密度試驗(yàn)

1.3.7.1 方法精密度 精密稱取磷酸替米考星可溶性粉0.25 g，置50 mL容量瓶中，超聲使其溶解，制成供試品溶液，稱取6份依次編號(hào)，分別精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算6次檢測的磷酸替米考星可溶性粉中替米考星的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，按《中國獸藥典》(2015版)中規(guī)定，待測成分含量10 %時(shí)，精密度RSD應(yīng)≤1.5%。

1.3.7.2 儀器精密度 為了確定所用儀器在相同色譜條件下多次測定結(jié)果的重現(xiàn)程度。試驗(yàn)選用Agilent 1100和Agilent1260 Ⅱ高效液相色譜儀對(duì)供試品溶液進(jìn)行考察，取10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別注入兩臺(tái)高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖至替米考星色譜保留時(shí)間的2倍，計(jì)算磷酸替米考星可溶性粉中替米考星含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取磷酸替米考星可溶性粉空白輔料，稱取9份，分別加入精密稱定的替米考星標(biāo)準(zhǔn)品10、12.5、15 mg各3份，置于50 mL容量瓶中，加磷酸溶液適量，加乙腈10 mL，超聲溶解，加磷酸溶液稀釋至刻度，制備出濃度分別為80%、100%、120%的低、中、高三個(gè)濃度水平的溶液，精密量取各溶液10 μL注入高效液相色譜儀，照含量測定法進(jìn)行測定，記錄色譜圖，分別計(jì)算回收率與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將磷酸替米考星可溶性粉制成50 μg/mL供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、6、8、12、16、20、24、36、48 h，采集不同時(shí)間段的色譜圖，考察供試品溶液變化情況。

1.3.10 耐用性試驗(yàn) 通過改變柱溫、流速以及不同品牌的色譜柱對(duì)色譜條件進(jìn)行微調(diào)，檢測磷酸替米考星可溶性粉在不同色譜條件下含量變化，考察其方法的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果見表1。5次測定的理論塔板數(shù)平均為5793，大于3000范圍要求；替米考星的順式和反式異構(gòu)體色譜峰之間的分離度為2.31，大于1.5范圍要求；替米考星(順式+反式)峰面積相對(duì)偏差為0.03%，替米考星順式異構(gòu)體保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00%，均小于1.0%，方法的系統(tǒng)性較好。

表1 方法系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.2 專屬性試驗(yàn) 專屬性結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，將溶劑空白(a)、輔料空白(磷酸溶液b、無水葡萄糖c、乳糖d)、替米考星對(duì)照品(e)和供試品(f)，按含量測定項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，溶劑空白、輔料空白對(duì)磷酸替米考星可溶性粉色譜峰均無干擾，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間一致，專屬性好。

圖1 專屬性HPLC色譜圖

2.3 線性 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法做線性回歸，替米考星(順式+反式)峰面積與對(duì)照品濃度呈線性關(guān)系的回歸方程為y=12048x-77.676，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，該結(jié)果表明替米考星在濃度為0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系圖

2.4 精密度試驗(yàn) 計(jì)算6次檢測的磷酸替米考星可溶性粉中替米考星含量、反式異構(gòu)體及順式異構(gòu)體峰的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%、0.06%及0.15%，均在可接受范圍內(nèi)。替米考星反式異構(gòu)體峰和順式異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間為0.9 min和1.0 min，方法精密度良好，符合獸藥典中規(guī)定的樣品待測成分含量10%時(shí)，RSD為1.5%范圍要求(表2)。

2.5 定量限和檢測限 按上述色譜條件，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，以信噪比3∶1測得磷酸替米考星檢測限為0.08 μg/mL(0.08%)，信噪比10∶1時(shí)的濃度定量限為0.3 μg/mL(0.3%)。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。擬定方法下測定的磷酸替米考星可溶性粉的回收率在97.27%～98.91%之間，三個(gè)不同濃度水平溶液的平均回收率為97.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.96%，替米考星的回收量與添加量一致，偏差為0.03%；符合《中國獸藥典》(2015版)中規(guī)定的當(dāng)樣品中待測成分含量10%時(shí)，回收率限度應(yīng)為95.0%～102.0%的要求。

表2 方法精密度計(jì)算結(jié)果

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果

2.7 溶液的穩(wěn)定性 試驗(yàn)結(jié)果，磷酸替米考星可溶性粉供試品溶液放置24 h內(nèi)峰面積未發(fā)生明顯變化，溶液較穩(wěn)定，RSD小于1.5%；放置36～48 h時(shí)，峰面積增寬增大，計(jì)算峰面積的含量不在標(biāo)示量范圍，相對(duì)偏差大于1.5%，溶液不穩(wěn)定，流動(dòng)相中四氫呋喃與二丁胺溶液易揮發(fā)，揮發(fā)后有機(jī)相濃度縮小供試品濃度增加，可能造成峰面積增大峰型增寬。

2.8 耐用性試驗(yàn) 耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表4。使用Aiglent ZORB(150×4.6 mm 5 μm)色譜柱時(shí)，色譜峰分離度最低，含量為105.30%；使用Aiglent ZORBA SB C18(250×4.6 mm 5 μm)色譜柱時(shí)，分離度高，含量為105.40%，使用兩種色譜柱測定的結(jié)果均符合《中國獸藥典》(2015版)中90.0%～110.0%標(biāo)示量范圍的要求。在不同柱溫下進(jìn)行測定，結(jié)果顯示測定的含量均在藥典規(guī)定范圍內(nèi)，但色譜峰保留時(shí)間有差異，溫度高出峰快，保留時(shí)間短。不同流速下測定結(jié)果顯示，三個(gè)不同流速條件下的含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，pH值測定含量平均為105.06%，檢測結(jié)果在可接受范圍內(nèi)，方法耐用性好，替米考星順式與反式異構(gòu)體分離度均大于1.5%。

表4 方法耐用性結(jié)果

2.9 不同公告方法檢測供試品含量 取四家執(zhí)行不同公告企業(yè)生產(chǎn)的樣品4批，將選擇的樣品分別采用公告2270、2455、2440、2172及擬定方法進(jìn)行含量測定(表5)，結(jié)果顯示應(yīng)用2440、2172、2455、2270號(hào)公告中的檢測方法時(shí)，替米考星色譜峰保留時(shí)間不一致，但在本研究擬定方法下色譜峰保留時(shí)間一致，含量測定結(jié)果一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%。應(yīng)用本研究擬定方法，4批樣品的檢測結(jié)果均符合4個(gè)公告中標(biāo)示量的90.0%～110.0%的要求。

表5 不同公告方法樣品測定結(jié)果

2.10 樣品測定 采用擬定方法對(duì)四家企業(yè)的11批樣品進(jìn)行了含量測定，并與各企業(yè)原公告方法的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果一致(表6)。11批樣品含磷酸替米考星按替米考星計(jì)，含量均在標(biāo)示量的90.0%～110%。

表6 樣品含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的考察 《中國獸藥典》(2015版)、《美國獸藥典》及四個(gè)公告中替米考星含量測定項(xiàng)色譜系統(tǒng)一致，均以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，僅比例不同，各比例下測定樣品結(jié)果一致。僅2440號(hào)公告流動(dòng)相比例配比超過1000，實(shí)驗(yàn)操作不便。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，采用水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃=805∶115∶25∶55為流動(dòng)相，磷酸替米考星可溶性粉中替米考星順式反式異構(gòu)體峰分離度良好，且與《中國獸藥典》中替米考星原料藥含量測定流動(dòng)相比例是一致的。

3.2 對(duì)照品處理方法的考察 四個(gè)公告中對(duì)照品處理方法有三種，2172號(hào)公告采用乙腈和流動(dòng)相處理，因流動(dòng)相中已含有乙腈，故此條件下處理增加了乙腈的用量，流動(dòng)相中還含有四氫呋喃，有刺激性氣味。對(duì)人體危害性較大，且對(duì)色譜柱有腐蝕作用；2240號(hào)公告使用磷酸溶液處理，因?qū)φ掌窞樘婷卓夹牵蝗苡谒?，在磷酸溶液中溶解較緩慢；2270和2455號(hào)公告均采用乙腈和磷酸溶液處理，與《中國獸藥典》替米考星原料藥對(duì)照品處理方法一致，本研究采用此法處理，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在能保證控制產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)上，減少了有毒試劑四氫呋喃和乙腈的使用。

3.3 供試品處理方法考察 各公告下處理的樣品所測得結(jié)果基本一致，方法間RSD均小于2.0%。但2172號(hào)公告采用乙腈和流動(dòng)相處理樣品，增加了有毒試劑四氫呋喃和乙腈的使用。并且實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)色譜峰前伸現(xiàn)象。本研究采用了同2445號(hào)公告和2270號(hào)公告一致的的處理方法,即選擇乙腈和磷酸溶液處理供試品，而且與對(duì)照品處理方法保持一致，減小了測定誤差，有效分離出了替米考星的順反式異構(gòu)體，輔料空白試驗(yàn)對(duì)色譜峰保留時(shí)間無干擾。

3.4 不同儀器保留時(shí)間考察 分別使用Agilent1260和Agilent1100兩臺(tái)儀器對(duì)供試品溶液在同一條件下進(jìn)行檢測，Agilent1260色譜儀中主峰保留時(shí)間都在8.2 min左右，理論塔板數(shù)最低可達(dá)30467，峰面積RSD為0.1%，保留時(shí)間RSD小于2%；Agilent1100色譜儀中主峰保留時(shí)間為7.8 min左右，理論塔板數(shù)最低可達(dá)11874，峰面積RSD為0.21%，保留時(shí)間RSD小于2%；對(duì)比分析兩臺(tái)儀器測定結(jié)果，色譜峰保留時(shí)間存在一定差異，但不同儀器上標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間與供試品色譜峰保留時(shí)間一致。

本研究建立的HPLC法測定磷酸替米考星可溶性粉中替米考星含量的分析方法，通過與4個(gè)公告對(duì)比分析，該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，回收率、精密度和穩(wěn)定性較理想，可為磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)，可用于磷酸替米考星可溶性粉整體質(zhì)量的控制和評(píng)價(jià)。