王志堅，王曉敏

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖教研室，浙江 嘉興 314001)

腦缺血再灌注損傷是一種臨床常見疾病，患者缺血再灌注后常常會導(dǎo)致殘疾甚至是死亡[1]，對患者和社會構(gòu)成了極大的負擔(dān)。再灌注時腦中神經(jīng)元常常出現(xiàn)DNA的破壞，同時DNA的修復(fù)能力也降低，進一步導(dǎo)致受損神經(jīng)元死亡[2]。以往研究表明，氟西汀對抑郁癥患者認知，神經(jīng)功能的改善有作用[3]，在腦缺血再灌注損傷中的作用尚未十分明確。本文主要探究氟西汀預(yù)處理對腦缺血再灌注(I/R)小鼠DNA損傷及修復(fù)蛋白Ku80和XRCC1的影響。

1 材料與方法

1.1動物和分組：C57成年健康小鼠120只，從浙江大學(xué)動物中心購買。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機編號，分成3組：假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)和氟西汀組(Fluo)，每組各40只，本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑：氟西汀(蘇州禮來公司)，Western blot試劑(碧云天)，K80和XRCC1抗體。

1.2.2建立I/R模型及給藥：根據(jù)改良Longa.Zea氏法制作I/R模型[4]。小鼠麻醉后，固定消毒剃毛，頸正中線處切口，分離各層組織，暴露右側(cè)頸部動脈。分別找出頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)，結(jié)扎CCA和ECA，ICA靠CCA處打一個活結(jié)，然后上端用小動脈夾夾住，CCA上開一個小口，插入線栓，線栓經(jīng)過ICA慢慢到大腦中動脈，阻斷大腦供血。缺血2 h后立刻取出魚線，結(jié)扎縫合，并進行消毒處理。將小鼠放置于溫暖的環(huán)境。假手術(shù)組只暴露動脈血管，并不結(jié)扎血管，不插入魚線阻斷供血，其他步驟相同。

1.2.3TTC染色：取各組小鼠新鮮大腦，置于-30℃冰箱速凍10 min，取出后冠狀切，厚度約2 mm,1%TCC染色浸泡，置于37℃水浴30 min后取出拍照。計算小鼠腦梗死體積比。

1.2.4Western blot：處死小鼠，迅速取腦，并分離缺血側(cè)的海馬組織，提取總蛋白，凝膠電泳(80 V,40 min與110 V,70 min),經(jīng)過轉(zhuǎn)膜封閉，加入抗體XRCC1和Ku80孵育過夜，第2天加入羊抗兔二抗，顯影定影，用軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠腦梗死體積比：由表1可知，與Sham組相比，I/R組在2 h、12 h、24 h、48 h后腦梗死體積明顯上升，而Fluo組在灌注24 h開始出現(xiàn)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。氟西汀預(yù)處理后，I/R組小鼠腦梗死體積減少。見表1。

表1 腦梗死體積比

2.2各組小鼠DNA損傷修復(fù)蛋白的變化：與Sham組相比，I/R組在2 h、12 h、24 h、48 h后DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白XRCC1和Ku80表達上升，而Fluo組再灌注2 h就開始出現(xiàn)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、表4。

表3 各組小鼠海馬XRCC1的含量測定

表4 各組小鼠海馬K80的含量測定

3 討論

腦缺血后，大腦許多結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生改變，此時若腦組織再次充血，即再灌注，腦組織的損傷不但得不到任何緩解，反而更加嚴重，主要表現(xiàn)在炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等方面，其中很嚴重的是神經(jīng)細胞發(fā)生代謝障礙，尤其是DNA損傷修復(fù)能力受到干擾，進一步導(dǎo)致細胞走向死亡。XRCC1和Ku80是哺乳動物DNA修復(fù)的關(guān)鍵蛋白[5-6]，檢測二者表達可以反映DNA損傷修復(fù)的功能。

氟西汀是突觸間隙5-HT再攝取的抑制劑，常用于抑郁癥的治療[7]，近年研究證明，氟西汀對I/R后神經(jīng)功能的恢復(fù)、學(xué)習(xí)記憶能力有一定的幫助，對I/R后抑郁也同樣有著治療效果[8]。本研究結(jié)果顯示，與I/R組相比，F(xiàn)luo組腦梗死面積明顯減小，再灌注2 h開始 DNA損傷及修復(fù)蛋白Ku80和XRCC1表達明顯上調(diào)。說明氟西汀預(yù)處理后，再灌注小鼠海馬DNA損傷修復(fù)蛋白Ku80和XRCC1表達增加，改善了再灌注小鼠海馬DNA損傷修復(fù)功能。