董建中，杜 斌

(中國(guó)人民解放軍第968醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是婦女在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖耐量異常性疾病，包括部分孕前已存在糖代謝異常而妊娠期被首次診斷的患者[1]，其患病率在亞洲婦女中為5%～10%，并且該比例在我國(guó)和某些發(fā)展中國(guó)家仍在不斷上升[2]。妊娠期糖尿病占妊娠期間的糖尿病80%以上[3]，未加控制的妊娠期高血糖可對(duì)母嬰產(chǎn)生較大的圍生期及遠(yuǎn)期危害，因此對(duì)妊娠期糖尿病的研究在臨床和科研方面受到越來越多的重視。探索建立一種妊娠期糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是對(duì)本病深入研究的基礎(chǔ)。以往所建立的糖尿病動(dòng)物模型多為非妊娠期動(dòng)物且所用動(dòng)物多為雄性[4]，對(duì)建立妊娠期糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的文獻(xiàn)罕見，本實(shí)驗(yàn)主要探索建立妊娠期糖尿病動(dòng)物模型的有效方法。目前建立糖尿病動(dòng)物模型主要以高糖食物誘發(fā)、化學(xué)藥物誘導(dǎo)和手術(shù)切除胰腺等方法為主。食物誘發(fā)與人類糖尿病發(fā)病機(jī)制比較接近，但耗時(shí)長(zhǎng)，飼養(yǎng)條件要求嚴(yán)格且動(dòng)物的死亡率高，限制了其應(yīng)用[5]；而化學(xué)藥物誘發(fā)糖尿病具有方法簡(jiǎn)單、血糖穩(wěn)定、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用相對(duì)廣泛[6]；手術(shù)切除胰腺具有創(chuàng)傷嚴(yán)重及影響胰腺外分泌，現(xiàn)已很少使用[7]。目前常用誘發(fā)動(dòng)物糖尿病的化學(xué)藥物有鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)[8]，由于鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)價(jià)格昂貴，建模成功率低，目前已較少使用。ALX誘導(dǎo)動(dòng)物糖尿病模型具有經(jīng)濟(jì)、方便、耗時(shí)短和動(dòng)物糖尿病模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用ALX成功地建立了妊娠期新西蘭兔糖尿病模型，并對(duì)其生物行為學(xué)、血糖和胰島素水平及胰島的病理組織學(xué)等改變進(jìn)行了觀察，探討其安全性、穩(wěn)定性、有效性和可行性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年新西蘭孕兔54只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購買，兔齡1～1.5年，體質(zhì)量3.0～4.3 kg，平均(3.87±0.24)kg，妊娠12～13 d，平均(12.30±0.46)d。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥品：ALX(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))，用前以注射用滅菌生理鹽水配制成質(zhì)量濃度5%的溶液，并用0.22 nm纖維素膜濾過除菌，用于誘導(dǎo)妊娠期兔糖尿病模型。

1.2.2血糖、尿糖及血胰島素測(cè)定儀器及試劑：德國(guó)羅氏MODLAR D/P型全自動(dòng)生化分析儀，溫州市維日康生物科技有限公司生產(chǎn)的葡萄糖檢測(cè)試劑盒，羅氏血糖儀及試紙。H-800全自動(dòng)尿分析儀，試紙為瑞迪H-800。胰島素測(cè)定試劑為美聯(lián)免疫永附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(RnD公司)。

1.2.3標(biāo)本處理：胰腺標(biāo)本用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋后進(jìn)行5 μm的連續(xù)切片，用蘇木素-伊紅染色(HE染色法)后光鏡(DMD108觀片機(jī)由Leica Microsystems公司)下觀察胰島組織變化及β細(xì)胞凋亡情況。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作：購回孕兔后，為降低死亡率，均在新環(huán)境條件下飼養(yǎng)2 d，觀察孕兔活躍、多動(dòng)、機(jī)警及皮毛光澤。禁食12 h后取晨尿測(cè)尿糖，陰性為合格孕兔。按給藥劑量的不同將孕兔隨機(jī)分為A組(對(duì)照組)和B組、C組(實(shí)驗(yàn)組)共三組，均靜脈抽血檢測(cè)空腹血糖及胰島素值，求其平均值作為基礎(chǔ)的空腹血糖值(兔空腹血糖正常參考值為4.33～8.61 mmol/L)及胰島素基礎(chǔ)值。A組6只孕兔經(jīng)耳緣靜脈給予注射15 ml生理鹽水；B組36只孕兔按100 mg/kg ALX經(jīng)耳緣靜脈注射，48 h后測(cè)血糖，誘導(dǎo)模型不成功者，繼續(xù)按100 mg/kg ALX靜脈注射，直至模型成功；C組為12只孕兔按130 mg/kg ALX靜脈注射，48 h后測(cè)血糖，誘導(dǎo)模型不成功者繼續(xù)按130 mg/kg ALX靜脈注射，直至模型成功。

三組均在給藥后密切觀察6 h，并用血糖儀隨機(jī)檢測(cè)血糖，如有低血糖者及時(shí)用50%的葡萄糖液15 ml灌胃。注射ALX滿48 h后開始檢測(cè)尿糖，每天1次；禁食12 h后經(jīng)耳緣靜脈抽血檢測(cè)空腹血糖，隔日1次。以尿糖持續(xù)(++)以上、血糖連續(xù)1周超過16.7 mmol/L并且保持穩(wěn)定為誘導(dǎo)模型成功[9]。期間觀察孕兔的飲食、尿量及精神狀態(tài)等情況。于第1周、2周及4周將造模成功的孕兔任取之一處死，取其胰腺做病理組織學(xué)觀察，并與正常孕兔胰腺組織學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1靜脈注射ALX后孕兔一般狀況：A組新西蘭孕兔在精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等方面無明顯的變化，體重增加(0.23±0.05)kg。B組和C組在給藥24 h后出現(xiàn)精神狀態(tài)差、少食懶動(dòng)、皮毛松散、失去光澤及脫毛等癥狀，其中16只孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)，流產(chǎn)后5只兔死亡，兔在死亡前出現(xiàn)驚厥、尖叫、角弓反張等癥狀。1周后模型成功并成活的32只孕兔出現(xiàn)多食、多飲、多尿及體重略上升(0.22±0.03)kg等癥狀。

2.2各組孕兔糖尿病模型成功率、流產(chǎn)率及死亡率的比較：A組6只孕兔糖尿病模型成功率、流產(chǎn)率及死亡率均為0；B組模型成功率明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組的流產(chǎn)率及死亡率均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3注射ALX前后孕兔血糖及胰島素水平的變化：在給藥前后，經(jīng)耳緣靜脈抽血檢測(cè)所有孕兔的空腹血糖及胰島素值，見表2。在給藥后2 h測(cè)血糖值略有升高[(7.10±0.65)mmol/L]，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在給藥后6 h血糖值下降明顯(4.23±0.27)mmol/L；給藥72 h后孕兔空腹血糖值均大幅上升(34.31±5.62)mmol/L，其中血糖>40 mmol/L的孕兔7只即時(shí)給予皮下注射胰島素(1 U/kg)，防止孕兔因高血糖引起流產(chǎn)及高滲性昏迷，甚至死亡。用藥 1周后血糖處于較高水平并保持相對(duì)穩(wěn)定。各組于用藥后第2周、第4周查空腹血糖及胰島素值。見表2。

2.4胰腺病理組織學(xué)觀察：正常孕兔胰腺HE染色后在低倍鏡可見，胰島形體規(guī)整、數(shù)量較多、分布密集；高倍鏡下可見胰島輪廓圓潤(rùn)及邊緣整齊，β細(xì)胞于胰島內(nèi)密集分布，見圖1a。與對(duì)照組相比，孕兔糖尿病組胰腺在低倍鏡下可見胰島呈萎縮狀，數(shù)量減少明顯，分布較稀疏，胰島β細(xì)胞的密度降低，見圖1b；在高倍鏡下見不到完整胰島，其形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，胰島胞漿內(nèi)空泡樣變明顯見圖1c；β細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核不規(guī)則、縮小，部分核濃染、核固縮，染色質(zhì)分布不均并聚集在核周，β細(xì)胞數(shù)明顯減少并分布在胰島周邊，大部分β細(xì)胞呈空泡狀，見圖1d。

表1 給藥后三組孕兔成功率、流產(chǎn)率及死亡率的比較

表2 三組孕兔注射ALX前、注射ALX后第2周及4周血糖及胰島素水平的比較

圖1 術(shù)前胸椎黃韌帶骨化MR、CT

3 討論

糖尿病是一種發(fā)病率較高的代謝性疾病，其并發(fā)癥對(duì)人類有較高的致殘率和死亡率，而妊娠期糖尿病對(duì)胎兒、嬰兒及孕產(chǎn)婦的危害更大，如易發(fā)生巨大兒、肩難產(chǎn)、出生后低血糖、低鈣和呼吸抑制等；孕產(chǎn)婦易發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓病及羊水過多等嚴(yán)重并發(fā)癥[10-11]。建立妊娠期糖尿病動(dòng)物模型對(duì)妊娠期糖尿病的基礎(chǔ)與臨床研究具有一定的科學(xué)意義。四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病模型是目前最常用的1型糖尿病動(dòng)物模型之一，是評(píng)價(jià)糖尿病的藥物治療及安全性的常用造模方法[12-14]，其機(jī)制是ALX化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，易與SH基(主要是半胱氨酸)發(fā)生反應(yīng)，而胰島的β細(xì)胞中SH基含量較其他組織多，故四氧嘧啶只選擇性地?fù)p害胰島的β細(xì)胞 ，使其合成胰島素減少，引起內(nèi)分泌功能紊亂，從而導(dǎo)致血糖升高、負(fù)氮平衡及體重下降而誘發(fā)該模型糖尿病[12]。此時(shí)糖尿病模型動(dòng)物可出現(xiàn)高血糖、尿糖、多飲多食等典型的人類糖尿病癥狀。以往所建糖尿病動(dòng)物模型多為非妊娠動(dòng)物，孕期糖尿病動(dòng)物模型罕見，本文選用新西蘭孕兔對(duì)其施加ALX，成功地建立了妊娠期糖尿病模型，該模型高血糖及低胰島素水平穩(wěn)定且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有明顯的糖尿病癥狀，胰島病理改變明顯，與人類糖尿病病理生理改變相似，所用方法具有造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、成本低、成功率高及易復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)[15]，以此方法建立的妊娠期糖尿病動(dòng)物模型可用來了解妊娠期糖尿病對(duì)孕產(chǎn)婦和胎兒及新生兒的影響，并為本病發(fā)生機(jī)理和臨床治療的研究提供了條件，具有一定的婦產(chǎn)科學(xué)意義。

采用ALX誘導(dǎo)動(dòng)物糖尿病模型應(yīng)注意[16-17]下幾方面：因?yàn)锳LX具有水溶性，長(zhǎng)時(shí)間溶于水會(huì)降低藥效，故應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配；用藥前試驗(yàn)用兔應(yīng)空腹，但禁食時(shí)間不宜過長(zhǎng)，時(shí)間超過24 h會(huì)增加兔的死亡率，以往研究及本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了以禁食12 h為佳；ALX劑量過大，增加藥物的毒性，引起動(dòng)物大量死亡，劑量過小而造模成功率低。本研究表明，劑量在100 mg/kg，按此體重劑量重復(fù)給藥相對(duì)理想，而130 mg/kg組孕兔發(fā)生流產(chǎn)率和死亡率均較高。另外造模成功率還受動(dòng)物的體重、動(dòng)物的年齡、ALX的生產(chǎn)廠家、藥物的給藥途徑及給藥速度等因素的影響。本研究是參考有關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，選用ALX的用量為100 mg/kg及130 mg/kg兩個(gè)量組，用藥后觀察孕兔糖尿病模型的成功率及對(duì)流產(chǎn)率和死亡率的影響。本文發(fā)現(xiàn)C組(130 mg/kg)注射藥物后，由于大量藥物對(duì)孕兔及其胎兔的毒性，導(dǎo)致8只孕兔流產(chǎn)，4只兔死亡，最終模型成功率為僅33.3%。B組(100 mg/kg)第1次注藥后孕兔無流產(chǎn)及死亡，動(dòng)物模型成功率為47.2%；在第2次給藥后模型成功率提高至77.8%，但出現(xiàn)8只孕兔流產(chǎn)，并且流產(chǎn)后1只兔死亡。因此，應(yīng)用100 mg/kg兩次給藥較130 mg/kg一次給藥方法的模型成功率明顯提高，而流產(chǎn)率及死亡率卻明顯的下降。由于孕兔的孕期較短(約30 d)，模型建立后可用于實(shí)驗(yàn)研究的剩余時(shí)間有限，可以選用其他孕期較長(zhǎng)的動(dòng)物制造糖尿病模型更佳，但需進(jìn)一步探討研究，而且費(fèi)用會(huì)有所增加。通過本實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用ALX制備孕兔糖尿病模型，是一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)、安全、可靠的方法，用小劑型多次給藥的方法優(yōu)于一次性大劑量給藥，降低了流產(chǎn)率、死亡率，提高了模型成功率。