張 丹，田 姍，李 翔，牟尚東

(三二〇一醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，陜西省漢中市723000)

肺癌是對(duì)人類威脅最大的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率和死亡率增長快，根據(jù)全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年新增肺癌確診患者約100萬人，約80萬人因肺癌死亡[1]。在中國，肺癌為排名第一位的惡性腫瘤，其病因至今尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與長期吸煙密切相關(guān)[2]。肺鱗狀細(xì)胞癌是肺癌常見類型，經(jīng)腫物切除、內(nèi)分泌治療、放化療等傳統(tǒng)治療手段治療后，生存率有所提高，但治療效果仍不理想。因此，從肺癌發(fā)病機(jī)制尋找突破口，研究其特異性生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶標(biāo)具有重要意義[3]。本研究對(duì)80例肺鱗狀細(xì)胞癌組織、80例癌旁正常肺組織的臨床特征及生存資料進(jìn)行回顧性分析，探討Erbin在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，為提高其臨床診治水平提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取本院2011年3月—2015年3月手術(shù)切除的80例肺鱗狀細(xì)胞癌組織以及同期80例癌旁正常肺組織標(biāo)本，均經(jīng)病理確診，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過化療或放療。肺鱗狀細(xì)胞癌組織80例，其中男51例，女29例，年齡35～84歲，中位年齡62歲，平均(57.3±6.1)歲；其中高分化28例，中分化32例，低分化20例；TNM分期[4]：Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例。同期癌旁正常肺組織80例，均距離腫瘤邊緣5 cm以上，經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤；其中男49例，女31例，年齡36～84歲，中位年齡62歲，平均(57.27±8.08)歲。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

所有患者均以門診復(fù)查、電話等方式隨訪，隨訪資料完整，剔除中途退出研究或失訪患者。隨訪時(shí)間為2015年3月—2020年3月，隨訪周期為第1年每3個(gè)月1次，第2～3年每3～6個(gè)月1次，第3～5年每6個(gè)月1次，5年后1年隨訪1次，生存時(shí)間以月為單位計(jì)算。

1.2 主要試劑

Erbin檢測(cè)應(yīng)用兔抗人多克隆抗體Erbin，購自英國Abcan公司，顯色劑為二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)和PV9000免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)二抗試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.3 臨床資料的搜集

通過查閱患者住院記錄、各種輔助檢查單、隨訪記錄等病案資料，采用統(tǒng)一調(diào)查表摘錄相關(guān)內(nèi)容，主要內(nèi)容包括年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、轉(zhuǎn)移情況、末次隨訪時(shí)間和生存時(shí)間等。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

石蠟包埋切片處理，復(fù)染脫水處理，采用高壓修復(fù)抗原，切片與一抗Erbin在4 ℃條件下孵育過夜，Erbin使用滴度為1∶100。第2天經(jīng)過磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)染色和DBA顯色處理，最后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

Erbin陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。由病理科醫(yī)師選擇腫瘤和癌旁正常肺組織的蠟塊做切片，染色成功后顯微鏡下任意選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞陽性著色強(qiáng)弱，未出現(xiàn)著色記為0分；淺黃色或者黃色記為1分；棕黃色記為2分；棕褐色記為3分。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分級(jí)：陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～30%為1分，30%～60%為2分，≥60%為3分。最后綜合陽性強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分，以兩者的乘積為最后得分。0～1分為Erbin陰性表達(dá)，2～12分為Erbin陽性表達(dá)[5]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組Erbin表達(dá)的比較

正常肺組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Erbin的陽性表達(dá)主要位于鱗狀上皮基底細(xì)胞，且定位在細(xì)胞的胞質(zhì)中。肺鱗狀細(xì)胞癌組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Erbin的陽性表達(dá)也定位在細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈淺黃色至棕黃色顆粒(圖1)。肺鱗狀細(xì)胞癌組織Erbin陽性61例，陽性率為76.25%，癌旁正常肺組織Erbin陽性15例，陽性率為18.75%，兩組Erbin陽性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.033，P=0.001)。

圖1 Erbin在正常肺組織、肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(100×)

2.2 肺鱗狀細(xì)胞癌組織Erbin表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

肺鱗狀細(xì)胞癌組織Erbin的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(P>0.05)；與患者腫瘤分化類型、腫瘤浸潤深度、臨床TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05；表1)。

表1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織Erbin表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 不同Erbin表達(dá)肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存情況的比較

80例肺鱗狀細(xì)胞癌患者隨訪存活1～73個(gè)月，中位生存期為36個(gè)月，術(shù)后1、3、5年生存率分別為76.25%(61/80)、52.50%(42/80)、33.75%(27/80)。Erbin表達(dá)陰性患者隨訪存活1～73個(gè)月，中位生存期39個(gè)月；Erbin表達(dá)陽性患者隨訪存活1～67個(gè)月，中位生存期27個(gè)月；Erbin表達(dá)陰性患者術(shù)后1、3、5年生存率(78.95%、52.63%和36.84%)明顯高于Erbin表達(dá)陽性患者(50.82%、32.79%和18.03%)(P<0.001；圖2)。

圖2 不同Erbin表達(dá)水平肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存曲線的比較

2.4 肺鱗狀細(xì)胞癌患者累積生存率單因素分析

經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)單因素分析顯示：不同年齡段、性別的肺鱗狀細(xì)胞癌患者，生存率比較差異無顯著性(P>0.05)；不同分化類型、臨床TNM分期、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、是否Erbin表達(dá)陽性的肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存率比較差異有顯著性(P<0.05；表2)。

表2 肺鱗狀細(xì)胞癌患者累積生存率單因素分析 單位：例(%)

2.5 肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后多因素分析

經(jīng)多元Cox逐步回歸分析，臨床分期晚(Ⅲ期)、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度>深層肌肉層、高分化類型、Erbin表達(dá)陽性為肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05；表3)。

表3 肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后多元逐步Cox回歸分析結(jié)果

3 討 論

肺鱗狀細(xì)胞癌是肺癌中的常見類型，因疾病進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療或放療抵抗等原因，手術(shù)時(shí)患者多已處于中晚期，且經(jīng)手術(shù)治療后，術(shù)后5年生存率仍然較低。隨著當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)、靶向治療等綜合治療的應(yīng)用，術(shù)后生存率有所提高，但肺癌仍然是人類致死的主要疾病之一[6-7]。近年來，分子生物學(xué)與基因技術(shù)不斷發(fā)展，惡性腫瘤診治水平邁上了新臺(tái)階[8]。Erbin是一種新的Her2相互作用蛋白，是LAP蛋白家族成員之一[9]。目前有研究報(bào)道，LAP家族蛋白Erbin、Seribble、Let413等在上皮細(xì)胞極性形成中發(fā)揮了重要作用[10]。Erbin在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有兩面性，文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，Erbin在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌患者中呈過表達(dá)，Erbin可通過調(diào)節(jié)ErbB2 的穩(wěn)定性和活性來調(diào)控乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展。而張珊等[13]在宮頸癌生物學(xué)分子標(biāo)志物的研究中發(fā)現(xiàn)，Erbin能通過抑制細(xì)胞進(jìn)程而降低癌細(xì)胞的增殖。然而，Erbin在肺鱗狀細(xì)胞癌中扮演何種角色尚存在爭(zhēng)論。

有研究顯示，Erbin在表皮上部細(xì)胞的細(xì)胞膜中染色，在皮膚表皮基底層細(xì)胞胞質(zhì)中染色，在表皮鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈淺黃色至棕黃色顆粒，表達(dá)水平顯著升高[14-15]。在本研究中，Erbin在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中呈淺黃色至棕黃色顆粒，陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常肺組織中陽性表達(dá)率，表明Erbin表達(dá)上調(diào)與某些腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且表達(dá)量與腫瘤的分期、進(jìn)展密切相關(guān)。本研究80例肺鱗狀細(xì)胞癌患者中61例Erbin表達(dá)陽性，且這些患者腫瘤浸潤深度>深層肌肉層，主要呈高分化類型，臨床TNM分期更高，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)果說明，Erbin在肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展中扮演了重要角色，其不僅參與了腫瘤的臨床進(jìn)展，也參與了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而在直腸癌患者研究中報(bào)道，Erbin蛋白表達(dá)量降低，并通過抑制ERK和Akt信號(hào)通路的活性而起抑癌作用[16-17]。故而，Erbin在不同信號(hào)通路中的作用仍然需進(jìn)一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，Erbin表達(dá)陽性的肺鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間明顯短于Erbin表達(dá)陰性患者，結(jié)果說明Erbin在肺鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展中扮演了促癌角色，Erbin可作為臨床上判斷腫瘤預(yù)后的參考指標(biāo)，對(duì)Erbin表達(dá)陽性的肺鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后應(yīng)進(jìn)行化療或放療輔助治療，以延長預(yù)后生存時(shí)間。然而經(jīng)過COX回歸模型分析顯示，Erbin表達(dá)陽性、臨床TNM分期高、腫瘤浸潤深度>深層肌肉層、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化類型等因素為肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此類腫瘤預(yù)后差可能是因?yàn)椋孩僭诜西[狀細(xì)胞癌患者中Erbin高表達(dá)使機(jī)體免疫受到抑制[18-19]；②同時(shí)Erbin過表達(dá)基因異常，癌細(xì)胞生長加快，侵犯脈管形成癌栓，從而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床進(jìn)展較快[20]。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)而在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在本研究中肺鱗狀細(xì)胞癌Erbin是否通過增強(qiáng)MMPs的活性而發(fā)揮促癌作用，需加大樣本量，借助肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系去進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Erbin的表達(dá)在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯增加，且Erbin陽性表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，這為將來開發(fā)針對(duì)Erbin的腫瘤靶向藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而明確Erbin促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制是本課題組下一步的研究方向。