于麗華，王 宏，秦 麗，張冬梅，崔東燕，趙書平

(1.海軍青島特勤療養(yǎng)中心檢驗(yàn)科，山東省青島市 266071；2.泰安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東省泰安市271000)

肝纖維化是肝細(xì)胞變性或壞死后機(jī)體發(fā)生的正常修復(fù)過程，其病理表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織在肝臟組織中過度沉積[1]，而慢性乙型肝炎患者均伴有不同程度肝纖維化，若不及時(shí)有效控制病毒感染程度，肝纖維化會進(jìn)展成肝硬化、肝癌等疾病，嚴(yán)重威脅患者生存質(zhì)量和生命安全[2]。若及時(shí)判斷乙肝患者纖維化分期，并對癥干預(yù)治療，將會逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化程度，降低肝硬化、肝癌等疾病發(fā)生率，進(jìn)而提高患者生存質(zhì)量[3]。目前臨床上以肝穿刺病理組織活檢為肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可有效診斷出肝纖維化病理分型，但其具有入侵性，患者依從性較差[4]。而血清指標(biāo)因其檢測快捷、耗時(shí)短及創(chuàng)傷小被臨床推廣，傳統(tǒng)肝纖維化血清診斷指標(biāo)雖具有快速、便捷的特點(diǎn)，但易受外界環(huán)境的干擾，診斷效能較低[5]。因而找尋高特異度和靈敏度的血清指標(biāo)，對提高肝纖維化臨床檢出率具有重要的作用。人尾肢同源蛋白2(human pygopus homolog 2, Pygo2)在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，有臨床研究證實(shí)其血清表達(dá)可反映肝纖維化病理分型[6]。Mac-2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一種廣泛分布于機(jī)體組織液、血液中的糖蛋白，其在肝纖維化患者體內(nèi)呈異常表達(dá)狀態(tài)[7]。上述指標(biāo)均可反映肝纖維化程度，但其聯(lián)合檢測乙肝肝纖維化的研究相對較少，本文對Pygo2、M2BPGi在慢性乙型肝炎肝纖維化患者血清中的表達(dá)及聯(lián)合診斷價(jià)值進(jìn)行研究，旨在為臨床研究提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2019年2月本療養(yǎng)中心收治的慢性乙型肝炎患者345例納入乙肝組，根據(jù)肝穿刺活檢病理結(jié)果，按肝纖維化分期將乙肝組分成S0組(n=49)、S1組(n=94)、S2組(n=53)、S3組(n=87)及S4組(n=62)。對照組為同期119例正常健康志愿者的血液樣本。本研究經(jīng)本中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象及家屬知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，有乙肝疾病史，乙肝表面抗原陽性表達(dá)時(shí)間>6個(gè)月；②接受肝穿刺活檢，并應(yīng)用2000年《病毒性肝炎防治方案》中擬定的肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[9]分組，臨床病理資料齊全。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并丙型肝炎等其他病毒性肝炎者；②合并患有惡性腫瘤者；③合并患有自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病患者；④酗酒或吸毒者；⑤不配合者。

1.2 肝纖維化病理分期標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)中國2000年肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[9]：S0期無纖維化；S1期匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3期纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4期早期肝硬化。

1.3 血清Pygo2和M2BPGi檢測

所有研究對象均于入組時(shí)采集空腹外周肘靜脈血4 mL，置于含促凝劑的分離膠黃頭管中，應(yīng)用Allegray 64R Centrifuge型離心機(jī)(美國Beckman Coulter)以3 000 r/min離心10 min，獲得血清分裝，-70 ℃保存，備用。應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo Multiskan公司，F(xiàn)C型)酶聯(lián)免疫法測定血清Pygo2和M2BPGi水平，試劑盒來自于上海江萊生物科技有限公司。

1.4 Pygo2和M2BPGi ROC曲線

以肝組織活檢為金標(biāo)準(zhǔn)[9]，繪制血清Pygo2和M2BPGi單獨(dú)及聯(lián)合診斷的ROC曲線，同時(shí)采用平行聯(lián)合診斷方式，即任一指標(biāo)為陽性，即可診斷為肝纖維化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料的比較

兩組受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)及性別等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表1)。與對照組比較，乙肝組谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、Pygo2和M2BPGi水平差異有顯著性(P<0.05)。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 各組血清Pygo2和M2BPGi水平的比較

與對照組比較，S0～S4組乙肝患者血清Pygo2和M2BPGi水平均明顯提高(P<0.01；表1)。隨著肝纖維化分期升高，血清Pygo2和M2BPGi水平升高(P<0.01)，且不同肝纖維化分期之間兩兩比較，差異均有顯著性(P<0.01；表2)。

表2 各組患者血清Pygo2和M2BPGi水平的比較

2.3 血清Pygo2和M2BPGi與肝纖維化病理分期的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，血清Pygo2、血清M2BPGi與肝纖維化分期均呈正相關(guān)(r=0.894,P=0.000；r=0.912,P=0.000)，箱線圖見圖1。

圖1 血清Pygo2和M2BPGi與肝纖維化病理分期相關(guān)性箱線圖

2.4 血清Pygo2和M2BPGi回歸分析及臨床診斷價(jià)值

分別以血清Pygo2和M2BPGi為自變量，以是否為S1和是否為S2為因變量，行非條件Logistic回歸分析，擬合得到回歸方程分別為logit(PS1)=-0.671+0.873XPygo2+0.892XM2BPGi和logit(PS2)=-0.701+0.873XPygo2+0.887XM2BPGi，結(jié)果見表3和表4。

表3 血清Pygo2、M2BPGi與S1分期的Logistic回歸分析

表4 血清Pygo2、M2BPGi與S2分期的Logistic回歸分析

2.5 血清Pygo2和M2BPGi單獨(dú)及平行聯(lián)合診斷價(jià)值的比較

以血清Pygo2和M2BPGi作為檢驗(yàn)變量，分別以S1和S2為狀態(tài)標(biāo)量，以靈敏度為Y軸，以“1-特異度”為X軸分別繪制ROC曲線(圖2)。

圖2 血清Pygo2和M2BPGi單項(xiàng)檢測及聯(lián)合診斷的ROC曲線圖

根據(jù)ROC曲線，血清Pygo2診斷S1的AUC為0.826(95%CI 0.774～0.877)。血清M2BPGi診斷S1的AUC為0.784(95%CI 0.758～0.810)。平行聯(lián)合檢測S1的AUC為0.903(95%CI 0.804～0.899)。血清Pygo2診斷S2的AUC為0.829(95%CI 0.779～0.867)；血清M2BPGi診斷S2的AUC為0.793(95%CI 0.763～0.815)。平行聯(lián)合檢測S2的AUC為0.908(95%CI 0.799～0.919)。

平行聯(lián)合檢測靈敏度顯著高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(P<0.05)，且聯(lián)合診斷的AUC顯著高于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(P<0.05)，平行聯(lián)合診斷時(shí)，任一指標(biāo)為陽性，即可診斷為S1或S2(表5和表6)。

表5 Pygo2、M2BPGi單項(xiàng)和聯(lián)合檢測AUC的比較

表6 Pygo2、M2BPGi單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷價(jià)值的比較

3 討 論

流行病學(xué)研究顯示，全世界約有2.4億乙肝患者，而其中40%患者會發(fā)展成肝硬化、原發(fā)性肝癌等疾病，嚴(yán)重降低患者生命安全[10-11]。文獻(xiàn)[12]研究表明，肝纖維化是病毒侵襲肝細(xì)胞所產(chǎn)生的正常修復(fù)生理反應(yīng)，是慢性肝病發(fā)展、惡化成肝硬化和肝癌等疾病的中間病理過程，具有可逆性特點(diǎn)，因而臨床診斷肝纖維化分型對疾病治療和預(yù)后恢復(fù)有重要的意義。目前臨床上多以影像學(xué)、血清學(xué)和肝組織活檢等手段診斷肝纖維化程度，彈性超聲等影像學(xué)技術(shù)具有無創(chuàng)、檢測方便等特點(diǎn)，對肝纖維化分型診斷具有重要意義，但其專業(yè)度高，設(shè)備昂貴，患者依從性較低[13]。血清學(xué)指標(biāo)因其具有方便、快捷及無創(chuàng)等特點(diǎn)已在臨床得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)為透明質(zhì)酸酶、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽和Ⅳ型膠原，但其單獨(dú)診斷效能較低，而這些指標(biāo)聯(lián)合診斷較為復(fù)雜，且其診斷結(jié)果仍需結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)一步判斷[14]。而血清Pygo2和M2BPGi均與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展及惡化有一定的相關(guān)性，且有研究證實(shí)，其可應(yīng)用于肝纖維化診斷，且診斷效能較高，但其具體在慢性乙肝患者體內(nèi)表達(dá)及其單獨(dú)、聯(lián)合診斷肝纖維化程度的研究相對較少[6,15]。

Pygo2蛋白是臨床新近發(fā)現(xiàn)的Wnt信號通路片段，可在細(xì)胞增殖分化、基因轉(zhuǎn)錄及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)乙肝病毒等侵襲機(jī)體肝細(xì)胞后，持續(xù)病毒感染會激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)并激活肝星狀細(xì)胞生物學(xué)功能，引發(fā)機(jī)體肝纖維化病癥的形成[16]。Tokunaga等[17]研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號通路在肝星狀細(xì)胞的活化和肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵功能，而Pygo2蛋白作為上述通路的關(guān)鍵組成結(jié)構(gòu)，可有效調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞表達(dá)水平，加重機(jī)體肝纖維化病變程度，且朱傳龍等[18]研究表明，血清Pygo2與丙肝肝纖維化程度呈明顯正相關(guān)。本文研究表明，隨著肝纖維化的進(jìn)程，血清Pygo2水平逐步提高，證實(shí)血清Pygo2與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且血清Pygo2與肝纖維化呈正相關(guān)。進(jìn)一步比較其診斷效能發(fā)現(xiàn)，血清Pygo2可有效預(yù)測機(jī)體肝纖維化，其單獨(dú)診斷的靈敏度和特異度仍較低，可能與Pygo2參與細(xì)胞增殖分化、基因轉(zhuǎn)錄過程等有關(guān)，因而需聯(lián)合其他因子以提高疾病診斷效能，與文獻(xiàn)[19]研究丙肝患者肝纖維化診斷結(jié)果相近。

M2BPGi是一種糖蛋白異構(gòu)體，可廣泛分布和存在于機(jī)體細(xì)胞液、組織液及血液中，具有細(xì)胞免疫、組成抗原及提高蛋白質(zhì)親水性等生物學(xué)功能[19]。M2BPGi是分泌性糖蛋白，可結(jié)合機(jī)體半乳凝素、膠原蛋白及纖連蛋白等物質(zhì)，促進(jìn)乙肝肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。Sato等[20]研究表明，M2BPGi水平在慢性肝病發(fā)展過程中逐步升高，因而其被臨床用于肝硬化、肝癌等疾病診斷。而肝纖維化病理研究表明[21]，肝星狀細(xì)胞可分泌合成M2BPGi，不受其他器官影響，具有良好的肝特異性。本文研究結(jié)果表明，隨著肝纖維化的進(jìn)程，血清M2BPGi水平逐步提高，證實(shí)血清M2BPGi與肝纖維化進(jìn)程有關(guān)，且Mark等[15]證實(shí)血清M2BPGi表達(dá)與肝纖維化進(jìn)程呈正相關(guān)，同時(shí)M2BPGi與紫藤多花凝集素特異性結(jié)合，共同參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及惡化過程。本研究表明，血清M2BPGi與肝纖維化呈正相關(guān)，進(jìn)一步比較其診斷效能發(fā)現(xiàn)，血清M2BPGi可有效診斷機(jī)體肝纖維化及其病理進(jìn)程，與文獻(xiàn)[22]研究丙肝患者肝纖維化診斷效能接近。

血清Pygo2和M2BPGi均是肝纖維化診斷的有效指標(biāo)，單獨(dú)檢測診斷效能偏低，近年來相關(guān)研究證實(shí)多技術(shù)手段或多指標(biāo)聯(lián)合診斷可提高肝纖維化診斷效能[22-24]，因而本文平行聯(lián)合檢測血清Pygo2和M2BPGi，任一指標(biāo)為陽性即可判定為存在肝纖維化或明顯纖維化。本研究結(jié)果表明，平行聯(lián)合檢測的靈敏度明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測，且保持一定的特異度和準(zhǔn)確度。同時(shí)，本研究應(yīng)用Logistic回歸綜合分析多項(xiàng)指標(biāo)，可綜合提高診斷效能。本研究結(jié)果基于345例慢性乙型肝炎患者，納入樣本量和樣本來源較為局限，仍需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量，納入多研究中心樣本，以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

綜上所述，血清Pygo2和M2BPGi二者單獨(dú)檢測對肝纖維化臨床診斷具有重要意義，且平行聯(lián)合檢測可提高肝纖維化診斷靈敏度，為肝纖維化早期診斷提供快速、便捷及準(zhǔn)確的方法。