肖潤穎，肖建華，王比男，李寒梅，郭海春，莫鴻英，黎小弟，任懂平，付 梟，柳紅艷，黎 麗，

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南省衡陽市 421001；2.長沙市婦幼保健院，湖南省長沙市 410007；3.優(yōu)生貝(北京)生物技術(shù)有限公司，北京市 102206)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指和同一性伴侶存在連續(xù)3次及以上、主要發(fā)生在孕28周之前的自然流產(chǎn)(spontaneous abortion，SA)[1]。RSA病因復(fù)雜，其潛在病因包括生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌代謝疾病、母體凝血功能異常、自身抗體的產(chǎn)生及感染等[2-3]。但40%～60%的RSA患者不屬于以上任何原因，確切原因尚不清楚，故稱不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[4]。有研究表明，成功的妊娠需要母體和胚胎之間保持動態(tài)的免疫平衡，一旦平衡狀態(tài)被打破，則可能導(dǎo)致母體對胎兒組織的排斥反應(yīng)，引起流產(chǎn)或者胚胎停止發(fā)育[5]。

探究URSA相關(guān)的基因表達(dá)譜和關(guān)鍵信號通路有助于臨床尋找新的治療靶點(diǎn)或標(biāo)記物，為此研究者們進(jìn)行了許多嘗試。Strug等[6]通過對子宮內(nèi)膜修復(fù)部位組織的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-sequencing，RNA-seq)，發(fā)現(xiàn)URSA的發(fā)生與子宮內(nèi)膜γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)等炎癥信號通路上調(diào)影響內(nèi)膜的修復(fù)有關(guān)，且轉(zhuǎn)錄因子RBPJ可能是其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。S?ber等[7]對早孕胎盤絨毛組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)主要參與DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄及加工、線粒體功能等，最關(guān)鍵的是大部分DEGs都受E2F/DP1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，且與不良妊娠結(jié)局發(fā)展或胎盤功能相關(guān)。Gu等[8]和Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)了白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)基因啟動子區(qū)相關(guān)位點(diǎn)存在多態(tài)性變異與URSA的發(fā)生相關(guān)。然而，目前對這些機(jī)制的認(rèn)識仍有許多疑問。

本研究采用RNA-seq對URSA患者與正常妊娠蛻膜組織轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行分析，運(yùn)用高密度單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)芯片檢測關(guān)鍵基因的位點(diǎn)多態(tài)性變異，從而探索母胎界面微環(huán)境的基因表達(dá)譜改變及與URSA發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因及遺傳因素，為URSA的分子免疫機(jī)制研究和臨床預(yù)防、診斷及治療提供一定參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究納入長沙市婦幼保健院2018年4月—2020年10月的15例患者；其中6例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦納入URSA組，9例既往無流產(chǎn)史且無其他異常的人工流產(chǎn)孕婦納入對照組。URSA組入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡21～40歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)19～24 kg/m2，孕周≤12周，連續(xù)自然流產(chǎn)次數(shù)≥3次。排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常，內(nèi)分泌、血栓史、感染、抗心磷脂抗體、染色體異常，孕期已接受黃體酮等藥物治療。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡21～40歲，BMI 19～24 kg/m2，孕周≤12周，妊娠狀況良好，既往無胚胎停育史，有一次以上正常生產(chǎn)史且子女健康者[3]。本研究經(jīng)長沙婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.2 樣本采集和預(yù)處理

選取URSA組4例及對照組3例孕婦，獲取其蛻膜組織，放入RNA組織保存液中充分滲透后(康為世紀(jì)，貨號：CWY042)迅速冷凍，并儲存在液氮中，以備后續(xù)RNA-seq檢測。URSA組及對照組所有患者各取2 mL外周血于一根EDTANa2一次性負(fù)壓采血管中，上下輕柔混勻，防止血液凝固，然后轉(zhuǎn)移到樣本凍存管中，-20 ℃凍存，待DNA提取和高密度SNP芯片檢測用。

1.3 RNA測序

提取1.2中蛻膜組織總RNA。對所提取的RNA完成質(zhì)量檢測(其中對照組1例RNA樣本不合格，棄去)，質(zhì)量檢測合格后進(jìn)行下一步的mRNA富集、片段化及cDNA合成。然后通過末端修復(fù)、加接頭及擴(kuò)增等步驟，完成文庫的構(gòu)建。文庫質(zhì)量檢測合格后上機(jī)進(jìn)行測序，測序及生物信息分析由優(yōu)生貝(北京)生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾及質(zhì)量控制后得到Clean Reads，然后通過軟件HISAT2(網(wǎng)址http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)比對至人類參考基因組(版本：GRCh38)，且需滿足對比到人類參考基因組的唯一比對率均超過90%的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)|log2(Fold Change)|>1，P<0.05的原則篩選出DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。并將DEGs比對到STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI network)，找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因并分析其可能的生物學(xué)功能。利用GSEA 3.0軟件(網(wǎng)址http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)進(jìn)行基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，富集標(biāo)準(zhǔn)為：|NES|>1，NOM p-val<0.05，F(xiàn)DR q-val<0.25；NES的正負(fù)分別指示基因集的升高和降低(NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)；FDR q-val：假陽性率；NOM p-val：標(biāo)準(zhǔn)化P值)。

1.5 高通量SNP芯片測序

采集URSA組和對照組外周血共15例，提取外周血DNA，使用高密度SNP芯片(ASA-CHIA，illumine，USA)對DNA樣本進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性基因型檢測，使用iScan平臺對SNP芯片進(jìn)行掃描分析，采用Bioconductor 軟件(版本號：v3.12，網(wǎng)址http://www.bioconductor.org/)對獲取的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。操作簡述為：將質(zhì)檢合格的DNA樣品移入MSA3平板上，經(jīng)片段化處理、恒溫擴(kuò)增、沉淀及重懸后與芯片孵育雜交，清洗后進(jìn)行單堿基延伸及染色操作后上機(jī)分析。使用iScan(Illumina，美國)對芯片進(jìn)行掃描及分析。所有實(shí)驗(yàn)操作流程均嚴(yán)格按照廠家標(biāo)準(zhǔn)操作說明書進(jìn)行。芯片數(shù)據(jù)分析軟件為 GenomeStudio(Illumina，美國，網(wǎng)址https://support.illumina.com/array/array_software/genomestudio/downloads.html)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床特征比較

兩組患者年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、孕周、入院HCG及入院孕酮水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 兩組患者臨床特征比較

2.2 相關(guān)性分析與差異表達(dá)基因的篩選

兩組數(shù)據(jù)的主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果如圖1所示，URSA組(n=4)和對照組(n=2)在轉(zhuǎn)錄水平能得到了較好的線性分離。以|log2(Fold Change)|> 2，P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得1 057個差異基因。與對照組相比，URSA蛻膜組織中上調(diào)表達(dá)基因469個，下調(diào)表達(dá)基因588個。由此構(gòu)建URSA患者基因差異表達(dá)熱圖(圖2)。

圖1 蛻膜組織RNA測序數(shù)據(jù)主成分分析U1～U4為URSA組4例樣本；C1～C2為對照組2例樣本。

圖2 DEGs等級聚類圖紅色表示基因表達(dá)量高，藍(lán)色表示基因表達(dá)量低。U1～U4為USRA組4例樣本；C1和C2為對照組2例樣本。

2.3 差異表達(dá)基因富集分析

GO富集分析結(jié)果如圖3所示，DEGs在生物過程中主要富集于T細(xì)胞活化與分化、白細(xì)胞趨化性、免疫應(yīng)答過程的負(fù)調(diào)控及Toll樣受體信號通路等(P<0.05)；在分子功能中主要富集于受體配體活性、抗原肽與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ)結(jié)合活性等(P<0.05)；在細(xì)胞成分中主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)、MHC蛋白復(fù)合物、MHC-Ⅱ類蛋白復(fù)合物、分泌性顆粒膜等(P<0.05)。KEGG富集分析結(jié)果如圖4所示，DEGs主要富集于吞噬體、金黃色葡萄球菌感染、抗原加工和遞呈、自身免疫病、同種異體移植排斥反應(yīng)、造血細(xì)胞譜系、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)及Toll樣受體信號通路等(P<0.05)。這些DEGs主要與炎癥反應(yīng)、異常免疫應(yīng)答、母體高凝狀態(tài)有關(guān)，不利于母胎免疫耐受的維持。

圖3 差異基因GO富集分析

圖4 差異基因KEGG富集分析圓形面積代表該信號通路富集的DEGs數(shù)量，面積越大DEGs數(shù)量越多；P.adjust由藍(lán)到紅色的過度色表示P校正值由大到小。

RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA通路富集分析結(jié)果如圖5所示，富集基因集參與的主要通路有IL-2/STAT5通路、PI3K/Akt通路、IL-10抗炎信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)通路、FOXP3信號通路的激活等，且這些信號通路均與Treg細(xì)胞活化及免疫抑制功能的發(fā)揮密切相關(guān)。以上信號通路的下調(diào)可能會影響Treg細(xì)胞的活化及免疫抑制功能發(fā)揮，使得URSA患者母胎界面的免疫平衡被打破，造成不良妊娠結(jié)果。

圖5 GSEA基因集富集分析圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

其中貢獻(xiàn)度排名前24的節(jié)點(diǎn)基因有CGB8、CGB5、MUC5AC、GPR183、SLC5A8、FOXS1、CD180、ALPP、HLA-DRB5、CXCL9、MMP27、UST、TUBA3D、SIGLEC14、STX11、BAMBI、HLA-DRB1、SLC2A12、PPP1R3C、SCGB3A1、SHISA3、SLC10A6、CD300C、XCL1等(圖6)。

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖圓代表蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，直線代表蛋白質(zhì)之間相互作用，線段粗細(xì)代表相互作用強(qiáng)弱。

2.5 SNP芯片檢測結(jié)果

使用高密度SNP芯片對URSA組(n=6)和對照組(n=9)關(guān)鍵差異基因HLA-DPA1、IL-2R、CD80、PTPRC、IRF4、CTLA4、XCL1、PDCD1、DUSP1、MAFB、TIGIT、IL-10、TRIB1的位點(diǎn)多態(tài)性變異進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示僅HLA-DPA1 基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs1042866、rs2567279)和IL-2RA基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs2025346)的等位基因頻率在兩組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2，P<0.05)。且HLA-DPA1 rs1042866位點(diǎn)C→T的突變可能減低URSA的發(fā)病風(fēng)險，而HLA-DPA1 rs2567279位點(diǎn)T→C的突變及IL-2RA rs2025346位點(diǎn)G→A的突變則可能提高URSA的發(fā)病風(fēng)險。其余關(guān)鍵基因SNP的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 SNP基因芯片篩選出的關(guān)鍵基因位點(diǎn)分布

3 討 論

RSA為常見的產(chǎn)科病癥，其患者及伴侶均承受了很大的身體、心理壓力。其中URSA的具體機(jī)制尚不明確，臨床的各種治療手段也無法取得讓人滿意的療效[10]，因此探究URSA病因，找到行之有效的診療方法已經(jīng)成為目前婦產(chǎn)及生殖醫(yī)學(xué)上急需解決的難題之一。目前認(rèn)為URSA發(fā)生主要與免疫因素相關(guān)，但其內(nèi)在的免疫調(diào)控機(jī)制及關(guān)鍵因素尚未明確[11]。

本研究采用RNA-seq對URSA與正常妊娠蛻膜組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：與對照組比較，URSA蛻膜組織中有1 057個差異表達(dá)基因(DEGs)，其中上調(diào)469個，下調(diào)588個。對DEGs進(jìn)行GO、KEGG、PPI及GSEA等生物信息學(xué)分析。GO分析顯示，DEGs主要富集于T細(xì)胞分化與活化、白細(xì)胞趨化性、抗原肽與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合活性及免疫應(yīng)答過程的負(fù)調(diào)控。KEGG分析顯示，DEGs主要與自身免疫病、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)及Toll樣受體信號通路等相關(guān)，這提示URSA的發(fā)生可能與炎癥信號通路的激活、母體對胚胎免疫耐受狀態(tài)的打破以及母體處于高凝狀態(tài)相關(guān)。為進(jìn)一步明確URSA患者蛻膜局部功能改變的機(jī)制，對DEGs進(jìn)行GSEA通路富集分析，發(fā)現(xiàn)URSA患者蛻膜組織的IL-2/STAT5通路、PI3K/Akt通路、IL-10抗炎信號通路、MAPK通路、TGF-β1通路、FOXP3蛋白激活通路等富集且表達(dá)下調(diào)。上述信號通路均與Treg細(xì)胞密切相關(guān)，這些通路的下調(diào)可能影響Treg細(xì)胞的活化及免疫抑制功能。Treg細(xì)胞是一群免疫抑制性T細(xì)胞，對妊娠的維持及母體耐受均起重要作用。其主要功能包括消耗IL-2，抑制NK細(xì)胞或殺傷性T細(xì)胞的殺傷作用，以及表達(dá)FOXP3、TGF-β、IL-10等免疫抑制性分子[12-13]。

綜合PPI及GSEA分析挑選出的核心DEGs有HLA-DPA1、IL-2RA、CD80、CTLA4、PDCD1、IL-10、PTPRC、IRF4、XCL1、DUSP1、MAFB、TIGIT及TRIB1，這些基因可能影響Treg細(xì)胞的功能，與URSA發(fā)生有關(guān)。HLA-DPA1屬于HLA-Ⅱ類α鏈旁系同源基因。能夠遞呈外源性抗原肽，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[14]。Shima等[15]發(fā)現(xiàn)，小鼠在孕前幾個小時內(nèi)就可以在陰道黏液中發(fā)現(xiàn)父系抗原和母系MHC-Ⅱ類細(xì)胞，可誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+Tregs的增殖，促進(jìn)對父系同種抗原的耐受。IL-2RA基因(即CD25)的突變與白細(xì)胞介素-2受體α缺乏有關(guān)。CD25為Treg細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子標(biāo)志，IL-2是啟動和維持Treg細(xì)胞增殖和分化的重要細(xì)胞因子，而Treg細(xì)胞表面的CD25分子能通過高效結(jié)合IL-2從而耗盡免疫微環(huán)境中的IL-2，維持母胎免疫耐受[12]。CD80(即B7)通過與T細(xì)胞表明的CD28或CTLA-4的結(jié)合而促進(jìn)或抑制T細(xì)胞活化及細(xì)胞因子產(chǎn)生。PDCD1(即PD-1)是活化的T細(xì)胞表達(dá)的一種免疫抑制受體，能抑制T細(xì)胞的活化，還可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，PD-1基因的下調(diào)與自身免疫病有關(guān)[16]。IL-10是Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞分泌的能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的最為重要的妊娠保護(hù)性細(xì)胞因子之一，該分子下調(diào)則不利于母胎界面免疫耐受的維持。PTPRC基因編碼的蛋白是T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，能夠抑制JAK激酶從而抑制IL-2/STAT5信號通路[17]。IRF4基因編碼蛋白是Ⅰ型干擾素基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄因子之一[18]。XCL1是趨化因子超家族成員，對T細(xì)胞具有特異性趨化作用[19]。DUSP1編碼的蛋白能使MAPK1/ERK2激酶去磷酸化，對細(xì)胞的增殖起負(fù)調(diào)控作用[20]。MAFB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)特異性造血細(xì)胞譜系中起重要作用。TIGIT能輔助調(diào)節(jié)T細(xì)胞對B細(xì)胞的應(yīng)答[21]。TRIB1主要參與脂質(zhì)代謝，影響M2型巨噬細(xì)胞及Treg的分化等[22]。綜上，共篩到的13個關(guān)鍵基因均與Treg細(xì)胞密切相關(guān)，這些基因的表達(dá)下調(diào)可能影響了Treg細(xì)胞分化及免疫抑制功能的發(fā)揮。

運(yùn)用高密度SNP芯片檢測兩組DNA樣本的基因位點(diǎn)多態(tài)性變異，發(fā)現(xiàn)除HLA-DPA1及IL-2RA外，其他的關(guān)鍵DEGs位點(diǎn)多態(tài)性在兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HLA-DPA1 rs1042866、HLA-DPA1 rs2567279及IL-2RA rs2025346等位基因頻率分布間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HLA-DPA1 rs1042866位點(diǎn)C→T的突變可能減低URSA的發(fā)病風(fēng)險，而HLA-DPA1 rs2567279位點(diǎn)T→C的突變及IL-2RA rs2025346位點(diǎn)G→A的突變則可能提高URSA的發(fā)病風(fēng)險。本研究為URSA發(fā)病機(jī)制的探究提供了新的思路和新靶點(diǎn)基因。

綜上所述，本研究通過比較URSA組及正常妊娠組蛻膜組織的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了1057個差異表達(dá)基因。在這些差異基因中有下調(diào)Treg細(xì)胞活化與功能的相關(guān)基因及促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的相關(guān)基因，它們可能使URSA患者母胎界面的免疫平衡被打破，造成不良妊娠結(jié)果。在蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因中，發(fā)現(xiàn)了3個新的與URSA相關(guān)的關(guān)鍵基因DUSP1、MAFB、TIGIT，它們的表達(dá)下調(diào)可能影響Treg細(xì)胞的活化及功能發(fā)揮。SNP芯片檢測顯示在URSA患者中存在HLA-DPA1 rs1042866、rs2567279及IL-2RA rs2025346基因位點(diǎn)多態(tài)性變異，可能影響URSA的發(fā)生。