劉慧晴，李 玄，孟星圻，王 璇，趙宗惠，賀修勝，李素云

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，2.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

胃癌(gastric cancer，GC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病部位隱匿，早期臨床癥狀不明顯，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)與診斷，嚴(yán)重危害人們的生命與健康安全。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尋找和探究胃癌早期診斷標(biāo)志物及其作用機(jī)制成為可能。有研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)在多種腫瘤中高表達(dá)，提示GRP78在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色，且其在腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[1]。本研究利用核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)干擾技術(shù)，構(gòu)建干擾GRP78蛋白短發(fā)夾RNA(GRP78-shRNA)載體，將干擾載體轉(zhuǎn)染至SGC-7901胃癌細(xì)胞中，觀察GRP78基因及蛋白質(zhì)表達(dá)情況，鑒定GRP78基因短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，為后續(xù)研究GRP78對胃癌發(fā)生發(fā)展作用及機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與試劑

RNA干擾質(zhì)粒購自海吉浩格生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone公司；XL1-BLUE MRF感受態(tài)細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；BamHI、EcoRI內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒、RNA總提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；Western blot凝膠配置試劑盒購自碧云天公司；胎牛血清購自Gibico公司；無血清K-SFM培養(yǎng)液、雙抗(青霉素、鏈霉素)購自華北制藥公司；BCA protein Assay Kit購自杭州四季青公司；0.25%胰酶、lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；鼠抗人單克隆抗體GRP78購自Abcam公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 GRP78-shRNA載體構(gòu)建

①GRP78基因信息：基因名稱為GRP78(HSPA5)，物種來源為Homo Sapiens，NCBI登錄號為NM_005347.4。②設(shè)計(jì)GRP78-shRNA序列并合成引物：用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。③PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序：GRP78-shRNA 行PCR擴(kuò)增，用BamHI 和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切目的載體和GRP78-shRNA PCR產(chǎn)物，37 ℃酶切3 h，GRP78-shRNA片段與線性化目的載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。挑取數(shù)個(gè)菌落，將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆測序，比對測序結(jié)果，質(zhì)粒抽提。

表1 GRP78-shRNA引物序列

1.3 GRP78-shRNA載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞

待細(xì)胞生長到70%～80%時(shí)，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將測序正確的GRP78-shRNA載體轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞，熒光檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qRT-PCR檢測GRP78基因的表達(dá)

反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s(收集熒光信號)；45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：溫度60～95 ℃，每分鐘讀1次。

引物序列：GAPDH:F:5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3′，R:5′-CCATGGTGTCTGAGCGATGT-3′；GRP78:F:5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′，R:5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′。

1.5 Western blot檢測GRP78蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA載體的SGC-7901細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，按BCA 法進(jìn)行蛋白定量，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴10 min，加樣，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用10%脫脂奶封閉1 h，加入一抗(1∶500)及GAPDH一抗(1∶2 000)工作液，4 ℃過夜，生物素標(biāo)記的二抗(1∶2 000)于室溫下孵育1 h，顯影拍照，分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GRP78-shRNA載體測序結(jié)果

根據(jù)GRP78基因序列設(shè)計(jì)構(gòu)建2個(gè)靶向GRP78-shRNA載體，抽提后，經(jīng)DNA測序，結(jié)果顯示RNA干擾載體與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的靶基因序列一致(圖1)，合成的GRP78-shRNA的DNA oligo序列插入正確，成功構(gòu)建GRP78-shRNA載體。

圖1 GRP78-shRNA1和GRP78-shRNA2質(zhì)粒的測序結(jié)果

2.2 GRP78-shRNA載體成功轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞

兩組GRP78-shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞可見綠色熒光，即GRP78-shRNA載體轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

2.3 qRT-PCR檢測GRP78-shRNA干擾結(jié)果

結(jié)果顯示GRP78-shRNA2較GRP78-shRNA1干擾效率更高(P<0.05；圖3、表2)。

2.4 轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA后SGC-7901胃癌細(xì)胞中GRP78的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA1和GRP78-shRNA2至SGC-7901細(xì)胞中，GRP78蛋白的表達(dá)量均降低，表明轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA成功降低了SGC-7901胃癌細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)，且GRP78-shRNA2干擾效果高于GRP78-shRNA1(P<0.05；圖4)。

圖3 qRT-PCR檢測GRP78-shRNA干擾效果1為SGC-7901；2為GRP78-shRNA1；3為GRP78-shRNA2。a為P<0.05，與SGC-7901比較。

表2 基因定量結(jié)果

圖4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA后GRP78蛋白的表達(dá)1為SGC-7901；2為GRP78-shRNA1；3為GRP78-shRNA2。a為P<0.05，與SGC-7901比較；b為P<0.05，與GRP78-shRNA1比較。

3 討 論

GRP78是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白家族(GRP)的重要成員之一，又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，可作為一種分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)，是正常生理狀態(tài)下促進(jìn)蛋白質(zhì)成熟和調(diào)節(jié)細(xì)胞機(jī)能的重要物質(zhì)[2]。當(dāng)機(jī)體處于低糖、低氧等條件下細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可誘導(dǎo)GRP78大量表達(dá)，因此，GRP78蛋白已成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白質(zhì)[3]。研究表明，GRP78在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，抑制ERK通路能阻斷GRP78表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[4]。同時(shí)GRP78高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)，并且促進(jìn)腫瘤血管生成[5]。目前關(guān)于GRP78通過何種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚不明確，但其在多種腫瘤中高表達(dá)說明GRP78在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中可能扮演重要角色，GRP78有望成為胃癌的診斷標(biāo)志和治療靶標(biāo)[6-8]。

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA誘發(fā)同源mRNA降解的技術(shù)，具有高特異性和高選擇性的抑制靶基因表達(dá)[9]。介導(dǎo)RNAi效應(yīng)的方法包括小干擾RNA(siRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)。siRNA制造的簡單性和劑量效應(yīng)的短暫性最適合于某些醫(yī)學(xué)疾病(即病毒注射)。然而，利用內(nèi)源性加工機(jī)制，優(yōu)化的shRNA結(jié)構(gòu)允許使用低拷貝數(shù)的高效價(jià)和可持續(xù)效應(yīng)，從而減少非靶向效應(yīng)，尤其是嵌入miRNA后。RNA干擾(RNAi)由于它具有特異性和高選擇性干擾靶基因表達(dá)，因此，常用RNAi技術(shù)敲低目的基因表達(dá)，RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、耐藥以及基因治療等[10-12]。shRNAs在基因沉默中起著重要的作用，在治療多種遺傳病和傳染病方面有著廣闊的應(yīng)用前景[13]。

課題組研究發(fā)現(xiàn)GRP78在胃癌中高表達(dá)，本研究通過RNAi技術(shù)，構(gòu)建了GRP78-shRNA載體，轉(zhuǎn)染至SGC-7901胃癌細(xì)胞中，經(jīng)熒光顯微鏡、qRT-PCR及Western blot，從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測GRP78基因表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染GRP78-shRNA載體后，SGC-7901胃癌細(xì)胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低，說明成功構(gòu)建并鑒定GRP78基因短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，并選取干擾效果好的載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)為深入探討GRP78對胃癌的發(fā)生發(fā)展作用及機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)。