劉 波，漆輝洲，王五洲，馬 云，肖方竹，郭思思，何淑雅

(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南省衡陽市421001)

過氧化氫(hydrogen peroxide)，俗稱雙氧水，分子式為H2O2，溶于水、醇、醚等[1]，廣泛應用于醫(yī)用、食品及工業(yè)消毒等領(lǐng)域，易分解為水和氧氣，無殘留毒性，不會造成環(huán)境的再次污染[2-3]。過氧化氫作為一種強氧化劑，可破壞線粒體功能和損傷脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)誘導氧化應激，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，進而啟動由Caspase介導的細胞凋亡途徑[4]，且ROS在各種信號通路介導的細胞增殖和炎癥反應中也起著重要作用[5-6]；一旦過氧化氫作用于細胞濃度超過某個水平，細胞會發(fā)生氧化應激反應，可導致細胞內(nèi)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[7]。

果蠅具有飼養(yǎng)簡便、反應靈敏、75%的基因與人類疾病相關(guān)基因同源等優(yōu)點[8]，且其發(fā)育過程和代謝機制與哺乳動物類似，故較多地將其應用于衰老或壽命等方面的研究[9]。本研究以W1118品系果蠅為實驗對象，通過喂食含過氧化氫的培養(yǎng)基，觀察果蠅的生長情況，研究過氧化氫對果蠅的壽命、生育能力、運動能力及抗氧化能力的影響，以期為過氧化氫對果蠅生長發(fā)育影響的研究提供證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

W1118品系果蠅，由本實驗室傳代保存。過氧化氫(上海雙儉)；丙酸(巴斯夫)；瓊脂粉(康倍斯)；酵母粉、蔗糖、黃豆粉及玉米粉(均購自沃爾瑪超市)；PBS緩沖液(賽默飛)；谷胱甘肽(glutathione,GSH)和過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒(默沙克)；恒溫箱(湖南中美)。

1.2 果蠅培養(yǎng)

玉米-酵母培養(yǎng)基，恒溫25 ℃，相對濕度65%?；A培養(yǎng)基的配制：取130 g玉米粉、77 g蔗糖、30 g大豆粉、13 g瓊脂粉以及900 mL蒸餾水倒入鍋中，煮沸30 min，待溫度降至55～60 ℃，加入6 mL丙酸和20 g酵母粉攪拌均勻后立即倒入培養(yǎng)管中，冷藏后使用[10-11]。過氧化氫培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中添加不同量的過氧化氫，攪拌均勻后倒入培養(yǎng)管中，配制成最終含400、800和1 200 mmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基，0 mmol/L過氧化氫的基礎培養(yǎng)基為對照組。

1.3 果蠅壽命測定

收集未交配的處女蠅和雄果蠅，隨后隨機挑取雌雄果蠅各50只放入基礎培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基中，每組設5個平行管。每日18:00對果蠅存活情況進行觀察和記錄，培養(yǎng)過程中每隔2天更換一次新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)觀察直至果蠅全部死亡。記錄數(shù)據(jù)并計算最高壽命(最后10只死亡果蠅的平均壽命)、壽命和半數(shù)死亡時間。

1.4 果蠅生育能力測定

在準備好的基礎培養(yǎng)基中放入果蠅，產(chǎn)卵12 h后移除親本，然后根據(jù)實驗要求采集1日齡幼蟲，分別放入到基礎培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基內(nèi)進行充分培養(yǎng)。各組培養(yǎng)基中均放置50只幼蟲，每組設5個平行管，觀察蛹化和羽化情況。蛹化率(%)=蛹化總數(shù)/卵總數(shù)×100%；羽化率(%)=羽化總數(shù)/卵總數(shù)×100%[12]。

1.5 果蠅羽化后48 h死亡率測定

在各濃度培養(yǎng)基羽化的成蟲中，均隨機挑選20只成蟲，每組設5個平行管，每隔8 h觀察成蟲存活情況直至48 h，以確定幼蟲羽化為成蟲后48 h的死亡率。果蠅羽化后48 h死亡率(%)=羽化后48 h死亡果蠅總數(shù)/羽化果蠅總數(shù)×100%。

1.6 果蠅運動能力測定

收集3日齡果蠅，分別放入基礎培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天后，每組隨機挑取50只果蠅且每組設5個平行管，輕晃果蠅至培養(yǎng)管底部并塞好瓶塞，記錄5 s內(nèi)果蠅到達培養(yǎng)管頂部的數(shù)量。攀爬指數(shù)(%)=5 s內(nèi)到達頂部的果蠅數(shù)/果蠅總數(shù)×100%[13]。攀爬指數(shù)越高說明運動能力越強，反之越小。

1.7 果蠅抗氧化活性測定

收集3日齡果蠅，從基礎培養(yǎng)基對照組和含400、800、1 200 mmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基處理組中每組隨機各挑取雌、雄果蠅20只于離心管中，每組設5個平行管，加入適量的PBS緩沖液，在液氮中充分研磨成10%組織勻漿[14]，4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清，嚴格按照默沙克公司的試劑盒操作說明測定GSH含量和CAT活力。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 過氧化氫對果蠅壽命的影響

400 mmol/L過氧化氫處理組雌雄果蠅半數(shù)死亡時間、最高壽命及雌果蠅壽命與對照組相比均明顯延長(P<0.05)，1 200 mmol/L過氧化氫處理組雌雄果蠅半數(shù)死亡時間、壽命及最高壽命與對照組相比均明顯縮短(P<0.05；圖1)；濃度為800 mmol/L條件下，雄果蠅平均壽命與對照組相比明顯縮短。

圖1 過氧化氫對果蠅壽命的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對照組比較。

2.2 過氧化氫對果蠅生育能力的影響

在800 mmol/L和1 200 mmol/L條件下，果蠅的蛹化率明顯低于對照組(P<0.05；圖2)；不同濃度過氧化氫處理組果蠅的羽化率均明顯低于對照組(P<0.05)，且果蠅生育能力隨著過氧化氫濃度的提高而逐漸減弱，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖2 過氧化氫對果蠅生育能力的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對照組比較。

2.3 過氧化氫對果蠅羽化后48 h死亡率的影響

400、800、1 200 mmol/L過氧化氫處理組果蠅羽化后48 h死亡率明顯高于對照組P<0.05；圖3)，且果蠅羽化后48 h死亡率隨著過氧化氫濃度的提高而逐漸升高，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖3 過氧化氫對果蠅羽化后48 h死亡率的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對照組比較。

2.4 過氧化氫對果蠅運動能力的影響

400、800 mmol/L、1 200 mmol/L過氧化氫處理組果蠅的運動能力與對照組相比均明顯減弱(P<0.05；圖4)，且隨著過氧化氫濃度的提高而逐漸減弱，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖4 過氧化氫對果蠅運動能力的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對照組比較。

2.5 過氧化氫對果蠅抗氧化活性的影響

800、1 200 mmol/L過氧化氫處理組果蠅GSH含量和CAT活力與對照組相比均明顯降低(P<0.05；圖5)。

圖5 過氧化氫對果蠅抗氧化活性的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對照組比較。

3 討 論

過氧化氫常用于醫(yī)用、環(huán)境和食品等領(lǐng)域的消毒，其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、細菌孢子和病毒等有抗菌效果，產(chǎn)生抗菌作用的機制可能是過氧化氫降解釋放的ROS導致DNA鏈斷裂[15]；同時，過氧化氫可經(jīng)皮膚、消化道及呼吸道等不同途徑進入人體產(chǎn)生一定的毒性[16-17]，產(chǎn)生毒性的機制主要有三種：腐蝕損傷、氧氣生成和脂質(zhì)過氧化[18]。果蠅易于操作，喂養(yǎng)簡單，繁殖力高、染色體數(shù)目少，且其代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段與哺乳動物類似等特性，故常被用作生物模型來研究動物行為、發(fā)育和抗衰老和抗氧化等[19-20]。本研究以W1118品系果蠅為研究對象，研究過氧化氫對果蠅壽命、生育能力以及運動能力的影響，并以GSH含量和CAT活力為指標評價了果蠅的抗氧化能力。結(jié)果表明:隨著過氧化氫濃度的增加，果蠅蛹化率和羽化率降低、運動能力減弱、羽化后48 h死亡率升高；當過氧化氫為400 mmol/L時，果蠅體內(nèi)GSH含量和CAT活力較對照組升高，可能是由于果蠅在低濃度過氧化氫刺激時，激活了果蠅體內(nèi)的保護機制，誘導產(chǎn)生了GSH和CAT，進而及時清除自由基，避免自由基對果蠅的進一步損傷，而當過氧化氫濃度較高時，果蠅機體產(chǎn)生的自由基超過了機體的清除能力，即GSH和CAT產(chǎn)生的速度跟不上機體內(nèi)自由基增加的速度，從而造成果蠅組織細胞的損傷，使GSH含量和CAT活力降低；當過氧化氫濃度為1 200 mmol/L時效果最為明顯(P<0.05)，這時果蠅體內(nèi)GSH含量和CAT活性與對照組相比明顯減少(P<0.05)；當過氧化氫濃度較高時，果蠅可能因此提前衰老、死亡、運動能力減弱甚至喪失生育能力。

昆蟲受到脅迫后會產(chǎn)生較多的ROS[21]。低水平的ROS對機體無害且在信號傳輸中起著很重要的作用[22]。當體內(nèi)ROS水平超過一定濃度時可導致昆蟲機體氧化損傷[7]，為了有效防止ROS對機體的破壞，昆蟲體內(nèi)可形成一個包括酶和非酶組分的抗氧化系統(tǒng)網(wǎng)絡[23]。過多的自由基細胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應，可破壞生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)，進而導致機體疾病甚至死亡[24-25]。過氧化氫可通過破壞正常線粒體功能和損傷DNA誘導氧化應激，本研究果蠅GSH含量和CAT活性減少，說明過氧化氫降低了果蠅對自由基及其產(chǎn)物的清除能力，從而造成果蠅功能障礙。

本研究結(jié)果表明，果蠅壽命縮短、生育能力和運動能力下降的同時，其體內(nèi)GSH含量和CAT活性也相應減少，說明過氧化氫對果蠅壽命、生育能力和運動能力的不利影響可能與其誘發(fā)的氧化損傷有關(guān)，機制可能是通過降低體內(nèi)抗氧化組分含量從而減弱抗氧化損傷的能力，使得體內(nèi)自由基積累導致?lián)p傷加劇，從而減弱了果蠅的生育能力和運動能力、加速了果蠅的死亡進程等。影響果蠅的生理生化功能的因素是多方面的，也是一個復雜且值得探討的課題。本研究為過氧化氫對果蠅生長發(fā)育的危害提供了理論依據(jù)，可為農(nóng)業(yè)園林害蟲防治工作提供參考意見，一定程度上可促進農(nóng)業(yè)園林業(yè)的發(fā)展，同時也可規(guī)范當下新冠肺炎疫情防控消殺用品等的正確使用。