沈萍，李雯，趙燕

(南昌市第九醫(yī)院，江西 南昌 330002)

近幾年，隨著人們飲食和生活習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病率迅速上升，目前已成為全球最主要的慢性肝病。其中，亞洲國家患病率約為27%，歐美等西方發(fā)達(dá)國家普通成人患病率為20%～33%，且患者呈年輕化趨勢[1-2]。目前仍然沒有針對非酒精性脂肪肝的標(biāo)準(zhǔn)化治療手段，盡管如此，糾正肝臟的脂代謝紊亂仍然是預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝的一個重要策略。當(dāng)肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂時，過多堆積的脂肪就會導(dǎo)致脂肪肝。研究表明[3-4]，飽和脂肪酸具有導(dǎo)致脂質(zhì)毒性的作用。棕櫚酸(PA)是人類血液中含量最高的一種飽和脂肪酸，其在正常范圍內(nèi)可發(fā)揮相應(yīng)的生理功能，但是在一些特定的病理條件下，組織內(nèi)的棕櫚酸異常增加，會打破組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，增加脂毒性，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。目前已知相關(guān)的疾病有高脂血癥、肥胖型心肌病、糖尿病以及腫瘤等[5-6]。吳茱萸次堿(Rut)是蕓香科植物吳茱萸中的一種重要生物活性堿，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中廣泛使用[7]，除具有抗炎、抑制癌基因、抗缺血等藥理學(xué)效應(yīng)外，還有抑制血小板聚集的心血管保護作用[8]。本研究從細(xì)胞層面上觀察吳茱萸次堿對脂質(zhì)損傷肝細(xì)胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

脂質(zhì)損傷肝細(xì)胞(LO2)細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；棕櫚酸鈉和熒光素鈉購自上海阿拉丁公司；吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、BSA-無脂肪酸(d-BSA)、4%組織細(xì)胞固定液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)、TC處理12孔板用細(xì)胞爬片、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)活性氧(ROS)熒光探針均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(CCK-8)試劑盒購自美國US Everbright Inc.公司；縫隙連接蛋白32(Cx32)抗體、縫隙連接蛋白26(Cx26)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體、過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自博士德生物工程有限公司；化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LO2細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清(FBS)和1%青/鏈霉素的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，放置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%時，用0.25%EDTA胰酶進行消化傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3.2 棕櫚酸和吳茱萸次堿溶液的配制

1.3.2.1 棕櫚酸溶液的配置

稱取33 mg棕櫚酸鈉粉末加入3 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，置于70 ℃水浴皂化約30 min。得到40 mmol/L棕櫚酸鈉皂化液，迅速加入至配制好的40% d-BSA溶液中，得到20 mmol/L PA溶液。適當(dāng)搖勻，置于50 ℃水浴助溶30 min。室溫冷卻后觀察性狀，呈棕黃色澄清樣，性狀穩(wěn)定。將PA存儲液于超凈臺中用0.22 μm無菌濾器過濾除菌，每管1 mL凍存于-20 ℃冰柜中。

1.3.2.2 吳茱萸次堿溶液的配置

稱取10 mg吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品粉末，溶解于10 mL甲醇中，得到3.48 mmol/L Rut溶液，將Rut存儲液于超凈臺中用0.22 μm無菌濾器過濾除菌，每管1 mL凍存于-20 ℃冰柜中。

1.3.3 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞接種于96孔板，每組6個平行孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；向孔內(nèi)加入不同濃度的Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，再向每個孔中加入最佳濃度的PA溶液，干預(yù)24 h后棄培養(yǎng)基。每孔加入100 μL CCK-8工作液(CCK-8母液∶DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基=1∶10)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，于450 nm處測定吸光度。

1.3.4 熒光檢測LO2細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化情況

取一塊12 孔板，每孔均放入TC處理12孔板用細(xì)胞爬片，然后每孔加入LO2細(xì)胞懸液，干預(yù)方式同前。干預(yù)結(jié)束后倒掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍；加入4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；PBS洗3遍，每孔加入1 mL含DCFH-DA熒光探針的工作液(5 μmol/L)作用60 min，終止探針作用時，用PBS清洗細(xì)胞2次，取出細(xì)胞爬片置于載玻片，用明膠封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 劃痕負(fù)載實驗檢測LO2細(xì)胞縫隙連接細(xì)胞間通訊的功能

利用熒光黃作為細(xì)胞內(nèi)熒光指示探針，可觀察細(xì)胞間的交流。取一塊12 孔板，每孔均放入TC處理12孔板用細(xì)胞爬片，然后每孔加入LO2細(xì)胞懸液，干預(yù)方式同前。干預(yù)結(jié)束后倒掉培養(yǎng)基，加入含有1%胎牛血清的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks′)液輕輕地清洗細(xì)胞2～3 次。往12 孔板中加入熒光黃溶液(0.5%)1 mL，用手術(shù)刀片在培養(yǎng)板中的玻片上劃痕，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 min后將染料吸出，再用含1% FBS的Hanks′液洗滌2～3 次，取出細(xì)胞爬片置于載玻片，用明膠封片后在熒光顯微鏡下觀察熒光黃染料的傳遞情況并拍照。

1.3.6 免疫印跡實驗檢測Cx26和Cx32蛋白表達(dá)

取一塊6 孔板，每孔加入LO2細(xì)胞懸液，干預(yù)方式同前。棄去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，提取細(xì)胞的總蛋白，采用二辛可寧酸法(BCA)測定蛋白濃度后，在蛋白中加入上樣緩沖液(蛋白體積∶上樣緩沖液=4∶1)，混勻后沸水中煮10 min，使蛋白質(zhì)變性，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉(zhuǎn)膜。采用Cx32，Cx26單克隆抗體和相應(yīng)二抗分別孵育，以ECL發(fā)光法進行顯影，β-actin作為參照物。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 藥物濃度的選擇

2.1.1 LO2細(xì)胞脂質(zhì)損傷模型的建立

以正常培養(yǎng)基和不同濃度的PA分別干預(yù)LO2細(xì)胞24 h，比較不同濃度的藥物對細(xì)胞增殖的影響(見圖1)，以毒性最小且有造模效應(yīng)的濃度作為PA造模濃度。與對照組相比，0.1 mmol/L PA組、0.2 mmol/L PA組、0.5 mmol/L PA組、0.8 mmol/L PA組、1 mmol/L PA組、2 mmol/L PA組細(xì)胞內(nèi)活力不斷下降，存活細(xì)胞不斷減少。最終選取0.2 mmol/L PA作為造模濃度。

未加入PA為對照組；**表示與對照組比較P<0.05

2.1.2 不同濃度吳茱萸次堿對LO2細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法分別檢測不同濃度Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)對LO2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示4個濃度對細(xì)胞均沒有毒性(見圖2)。分別選取0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L三個濃度作為低劑量Rut組、中劑量Rut組和高劑量Rut組完成后續(xù)實驗。

未加入Put為對照組

2.2 吳茱萸次堿對脂質(zhì)損傷細(xì)胞的活力作用

與對照組相比，給予0.2 mmol/L PA處理后LO2細(xì)胞的活力顯著降低，不同濃度的吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)均能抑制脂質(zhì)損傷所致的LO2細(xì)胞活力的下降(見圖3)。

1為對照組，即未加入PA和Rut；2為0.2 mmol/L PA組；3為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；4為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；5為0.2 mmol/LPA+1 μmol/L Rut組；##表示與對照組比較P<0.05，**表示與0.2 mmol/L PA組比較P<0.05

2.3 吳茱萸次堿對脂質(zhì)損傷細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

藥物干擾LO2細(xì)胞后，采用熒光檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)情況，如圖4顯示，與對照組比較，PA刺激細(xì)胞后ROS增加，而預(yù)先給予吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS增加。

a為對照組，即未加入PA和Rut；b為0.2 mmol/L PA組；c為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；d為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；e為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組；綠色熒光代表ROS

2.4 吳茱萸次堿對脂質(zhì)損傷細(xì)胞縫隙連接細(xì)胞間通訊功能的影響

劃痕負(fù)載實驗結(jié)果顯示，與對照組對比，PA可顯著抑制熒光黃染料的傳遞，預(yù)先給予Rut(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)可顯著改善高脂誘導(dǎo)的縫隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)功能障礙(見圖5)。

a為對照組，即未加入PA和Rut；b為0.2 mmol/L PA組；c為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；d為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；e為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組；綠色熒光代表代表熒光黃探針

2.5 吳茱萸次堿對縫隙連接蛋白Cx26和Cx32表達(dá)的影響

免疫印跡實驗(Western blotting)結(jié)果顯示，與對照組比較，PA組Cx32和Cx26的蛋白表達(dá)水平顯著下降，不同劑量的吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)均可恢復(fù)Cx32和Cx26蛋白的表達(dá)水平(見圖6)。

1為對照組，即未加入PA和Rut；2為0.2 mmol/L PA組；3為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；4為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；5為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組

3 討 論

近幾年來，縫隙連接(GJ)在肝臟疾病中的作用日益受到重視。GJ是溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的細(xì)胞間通道，允許相對分子質(zhì)量小于1.5 kD的離子、代謝物及第二信使(如cAMP，Ca2+，IP3)通過。細(xì)胞間普遍存在GJ，相鄰細(xì)胞通過GJ進行信息和物質(zhì)能量的交流，在組織生長發(fā)育、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞分裂分化和腫瘤形成發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。GJ由相鄰細(xì)胞膜上的兩個連接子互相錨定組成，而連接子則是由六個啞鈴型蛋白亞單位-連接蛋白(Cx)組成的六聚體。肝臟結(jié)構(gòu)中存在豐富的GJ，廣泛參與肝臟的生理功能，甚至發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前已有多達(dá)5種Cx在肝臟中被檢出，其中肝細(xì)胞主要表達(dá)Cx32和Cx26，而非實質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)Cx37，Cx40和Cx43[10]。因此，本研究的目的之一是觀察高脂狀態(tài)的肝細(xì)胞中Cx32，Cx26的表達(dá)和GJIC功能的變化。

吳茱萸次堿是傳統(tǒng)中藥吳茱萸的主要有效成分，是一種吲哚喹唑啉類生物堿，具有廣泛的藥理效應(yīng)，例如緩解消化性潰瘍、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗炎等，這些作用可能與下調(diào)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性，減少ROS產(chǎn)生密切相關(guān)[11]。已有研究表明，Rut可減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，恢復(fù)內(nèi)皮Cx37表達(dá)和GJIC的功能[10]，故而本研究首次在細(xì)胞層面上探討吳茱萸次堿對脂質(zhì)損傷肝細(xì)胞的縫隙連接蛋白和(GJIC)功能的影響。

棕櫚酸是飽和游離脂肪酸的一種，已廣泛應(yīng)用于脂毒性誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立[12]。本研究利用PA建立人肝細(xì)胞的脂質(zhì)損傷模型，結(jié)果顯示，PA刺激細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、細(xì)胞內(nèi)活性氧增加、GJIC功能障礙以及Cx32和Cx26表達(dá)量減少；使用吳茱萸次堿預(yù)處理LO2細(xì)胞后，可減輕PA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并且恢復(fù)Cx32和Cx26的表達(dá)和GJIC的功能[13]。本研究通過探討肝細(xì)胞Cx32和Cx26表達(dá)及通訊功能的變化，為治療非酒精性脂肪肝提供潛在的靶向治療位點、顯著改善NAFLD臨床預(yù)后以及開發(fā)新作用靶點的抗脂肪肝病變藥物提供思路。