李 博 劉合霞 劉 秦 周興文

（廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，玉林師范學(xué)院，玉林 537000）

金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科（Thea?ceae）山茶屬（Camellia）植物，主要分布于我國(guó)廣西南部地區(qū)及越南北部地區(qū)，是山茶屬中唯一具有金黃色花瓣的珍稀植物類群，素有“茶族皇后”“植物界的大熊貓”的美譽(yù)［1］。金花茶花瓣金黃色，具有較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)也是一種藥食兩用植物，含有茶多酚、茶多糖、黃酮類等生理活性成分，此外還含有對(duì)人體健康有益的多種微量元素，如鍺、錳、有機(jī)硒等元素［2］，具有清熱解毒、利尿消腫等功效，可用于治療高血壓、咽喉炎、便血、痢疾、月經(jīng)不調(diào)等疾病，另外，現(xiàn)代藥理學(xué)的研究也表明金花茶具有殺菌、抗癌、防治“三高”等作用［3～5］。金花茶的花朵是主要的開發(fā)利用資源，而它的觀賞性和藥用價(jià)值很大程度上取決于花瓣的顏色及大小。因此，對(duì)金花茶花瓣發(fā)育進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

花瓣在大小、形狀和顏色上變化很大，這種變異對(duì)異交物種中吸引傳粉昆蟲具有重要的適應(yīng)性意義［6～7］?；ò暌恢笔菆@藝家們選擇改良的目標(biāo)，通過(guò)對(duì)花瓣性狀的改良可以提高植物的觀賞價(jià)值［8］。目前，花瓣已經(jīng)成為植物器官發(fā)生研究的一個(gè)獨(dú)特模型系統(tǒng)，因?yàn)榛ò陮?duì)于植物的生長(zhǎng)是可有可無(wú)的，花瓣存在與否對(duì)植物自身的生存能力影響相對(duì)較?。?］；此外，花瓣的形狀和大小在很大程度上不受環(huán)境波動(dòng)的影響［10］，上述特點(diǎn)使得它成為了分析器官發(fā)育的理想遺傳控制系統(tǒng)。

在金花茶花瓣的發(fā)育過(guò)程中，其花瓣表型會(huì)發(fā)生明顯的變化。這一過(guò)程始于綠色小花瓣的形成，它經(jīng)歷了一個(gè)主要由細(xì)胞分裂驅(qū)動(dòng)的早期生長(zhǎng)階段，并伴隨著色素開始合成；此時(shí)，花瓣細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，但色素含量迅速增加，直至產(chǎn)生色素沉著，形成黃色的花瓣；隨后，通過(guò)花瓣細(xì)胞的擴(kuò)張，使花瓣達(dá)到最終的大小。雖然許多研究探討了模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育 調(diào) 控 機(jī) 制［11］，玫 瑰（Rosa chinensis）［12］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［13］等園藝植物花瓣伸長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，以及金花茶花瓣的色素苷生物合成的相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)制［14］，但是控制金花茶花瓣發(fā)育及伸長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制卻知之甚少。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq 測(cè)序可用于分析整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，通過(guò)檢測(cè)unigene 表達(dá)的變化，可得到大規(guī)模的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。因此，本研究對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的金花茶花瓣進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，以期揭示激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子家族在花瓣生長(zhǎng)調(diào)控中的關(guān)系，建立與金花茶花瓣生長(zhǎng)相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)信息，為深入研究金花茶花瓣在轉(zhuǎn)錄水平上的發(fā)育調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為金花茶分子育種實(shí)踐及資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取及分析

此次研究所使用的數(shù)據(jù)來(lái)源于本課題組前期測(cè)序所獲得的金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。在前期的研究中，根據(jù)花瓣的表型特征，將金花茶的開花過(guò)程劃分為幼蕾期（S1）、初蕾期（S2）、顯色期（S3）、半開期（S4）、盛開期（S5）等5 個(gè)時(shí)期（見圖1），采集每個(gè)時(shí)期的花瓣進(jìn)行3 次轉(zhuǎn)錄組重復(fù)測(cè)序，共獲得15個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本，該數(shù)據(jù)已上傳至NCBI（national center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取碼為PRJNA392895［14］。

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Raw reads）中低質(zhì)量的序列讀序（Reads）去除，然后使用Trinity 軟件［15］組裝干凈讀序（Clean reads），并對(duì)其進(jìn)行拼接，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)錄本序列（transcripts）；將轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行同源聚類和拼接，從而得到unigene；隨后利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Nr，Swiss Prot，KOG，Pfam，GO，KEGG）對(duì)得到的金花茶花瓣的unigene進(jìn)行注釋，要求E值<1E-5。

1.2 金花茶基因表達(dá)水平分析及差異表達(dá)基因的篩選

利用軟件RSEM［16］，把15 個(gè)樣品中的干凈序列（Clean reads）與Trinity 軟件拼接得到的金花茶轉(zhuǎn)錄組參考序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)在每個(gè)樣品中比對(duì)到每個(gè)基因上的reads 的數(shù)目（Readcount），并將其轉(zhuǎn)換成FPKM 值（expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）［17］，分析開花過(guò)程中金花茶基因的表達(dá)水平。隨后采用DESeq 軟件［18］，檢測(cè)不同開花時(shí)期花瓣的差異表達(dá)基因（differentially ex?pressed genes，DEGs），將5 個(gè)時(shí)期的金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)開花過(guò)程的先后順序進(jìn)行兩兩比對(duì)，獲得了S2-VS-S1、S3-VS-S2、S4-VS-S3和S5-VSS4等4個(gè)比較組，篩選其中的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為FDR≤0.001，差異倍數(shù)大于2，且Padj<0.05。

1.3 開花過(guò)程中金花茶差異表達(dá)基因的富集分析及趨勢(shì)分析

對(duì)所獲得的金花茶差異表達(dá)基因的GO 功能富集，主要采用GOseq 進(jìn)行分析［19］；而對(duì)于所有金花茶差異表達(dá)基因KEGG 通路的富集分析，則主要采用KOBAS（2.0）來(lái)完成［20］，通過(guò)對(duì)金花茶花瓣差異表達(dá)基因的富集分析，進(jìn)而挖掘開花過(guò)程中調(diào)控金花茶花瓣發(fā)育的相關(guān)基因。為了分析不同開花時(shí)期金花茶的基因表達(dá)趨勢(shì)，首先，根據(jù)花朵開放的先后順序，對(duì)5個(gè)不同開花時(shí)期的金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比對(duì)；然后再利用STEM 軟件［21］，對(duì)4個(gè)比較組的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，進(jìn)而篩選顯著性的基因表達(dá)集合，顯著性的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.4 開花過(guò)程中金花茶高表達(dá)基因的篩選及富集分析

為研究高表達(dá)基因在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中的功能，計(jì)算每個(gè)unigene 在花瓣發(fā)育5 個(gè)時(shí)期的FPKM 平均值，將FPKM 均值大于100 的unigene 認(rèn)為是高表達(dá)基因［22］；隨后利用KOBAS（2.0）對(duì)高表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。

1.5 金花茶差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇3 個(gè)在金花茶花瓣發(fā)育中差異表達(dá)基因，使用Primer Premier（5.0）軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證。利用試劑盒（Invitrogen）將提取到的各樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA 為模板，選擇18S rRNA 作為內(nèi)參基因，在ABI 7500FAST 熒光定量PCR 儀（ABI公司，美國(guó)）進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)按照SYBR Green Dye 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用2-??CT法計(jì)算差異基因的相對(duì)表達(dá)量［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶開花過(guò)程中差異表達(dá)基因分析

根據(jù)花朵開放的先后順序，對(duì)5個(gè)不同開花時(shí)期的金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行兩兩比對(duì)，4個(gè)比較組中共獲得了1 922個(gè)差異表達(dá)基因（見圖2）。在S2 與S1 比較組中，共檢測(cè)到76 個(gè)差異表達(dá)基因；在S3 與S2 的比較組中，檢測(cè)到的差異表達(dá)基因數(shù)量有較大的增加，為325個(gè)；而在S4與S3的比較組中，檢測(cè)到的差異表達(dá)基因數(shù)量則最少，僅有11個(gè)；最后在S5 與S4 的比較組中，檢測(cè)到的差異表達(dá)基因?yàn)? 473個(gè)，數(shù)量最多，其中870個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)，603個(gè)下調(diào)表達(dá)；結(jié)果表明，金花茶的半開期（S4）與盛開期（S5）可能是金花茶開花過(guò)程中比較關(guān)鍵的階段，這兩個(gè)階段的差異表達(dá)基因可能在開花的調(diào)控機(jī)制中具有重要的作用。對(duì)4 個(gè)比較組中的1 922 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋，3 個(gè)一級(jí)分類單位包含37 個(gè)二級(jí)分類功能組。生物學(xué)過(guò)程中所包含的二級(jí)分類單位數(shù)量最多，有17個(gè)，差異表達(dá)基因主要集中在代謝進(jìn)程（metabolic process）、單有機(jī)體進(jìn)程（single-organ?ism process）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）等二級(jí)分類單位中；其次為分子功能，該分類單位主要集中在催化活性（catalytic activity）、結(jié)合（binding）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）等二級(jí)分類單位中；而細(xì)胞組分所含的二級(jí)分類單位則最少，且主要集中在細(xì)胞膜（membrane）、細(xì)胞膜部分（membrane part）和細(xì)胞（cell）等分類單位中。GO 功能分類結(jié)果表明金花茶花瓣差異表達(dá)基因的表達(dá)主要與代謝進(jìn)程、單有機(jī)體進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程、催化活性、結(jié)合等相關(guān)聯(lián)（見圖3）。

2.2 金花茶差異表達(dá)基因的富集分析

對(duì)4個(gè)比較組中獲得的1 922個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，3個(gè)一級(jí)分類單位，生物過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及 細(xì) 胞 組 分（Cellular Component，CC）分別富集到17、9、11 個(gè)二級(jí)生物過(guò)程，其中富集達(dá)到顯著水平的GO 分類共有33 個(gè)，主要有水解酶活性（GO：0016787）、酶抑制劑活性（GO：0004857）、催化活性（GO：0003824）、糖類化合物代謝過(guò)程（GO：0005975）、碳—氧裂解酶活性（GO：0016838）、生物膜（GO：0016020）等（見圖4）；其中二級(jí)GO 分類單元催化活性（catalytic activity，GO：0003824），它所含有的三級(jí)GO 分類單元水解酶（hydrolase activity，GO：0016787）、四級(jí)GO 分類單元糖基鍵水解酶（hydrolase activity，acting on glyco?syl bonds，GO：0016798）、五級(jí)GO 分類單元水解O-糖基化合物水解酶（hydrolase activity，hydrolyz?ing O-glycosyl compounds，GO：0004553）均表現(xiàn)為顯著富集，這些分類單元包含的unigene 以木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（（Xyloglucan endotransgluco?sylase/hydrolase，XTH）為主，GO 功能富集分析結(jié)果表明，金花茶開花過(guò)程中差異表達(dá)基因的功能主要與糖的合成、分解與代謝，酶的活性與催化，化學(xué)鍵的生成與斷裂，生物膜的合成以及電子載體活性有關(guān)。而1 922 個(gè)差異表達(dá)基因被富集到了77條KEGG 的Pathway 中，其中富集達(dá)到顯著水平的KEGG 通路共有9個(gè)，具體的通路為類苯基丙烷生物合成（ko00940）、類黃酮生物合成（ko00941）、次生代謝物的生物合成（ko01110）、植物晝夜節(jié)律（ko04712）、油菜素甾醇生物合成（ko00905）、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化（ko00040）、角質(zhì)，亞氨酸和蠟生物合成（ko00073）、代謝途徑（ko01100）和醚脂類代謝（ko00565）（見圖5）。KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金花茶花瓣差異表達(dá)基因的功能主要與次生物質(zhì)代謝、激素合成與傳導(dǎo)、糖類和脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

2.3 調(diào)控金花茶花瓣發(fā)育的基因挖掘

為尋找調(diào)控金花茶花朵開放及花瓣發(fā)育的相關(guān)基因，利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行注釋，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，總結(jié)前人的研究成果，從所有unigene中篩選出137個(gè)可能與花朵開放及花瓣發(fā)育的差異表達(dá)基因。根據(jù)它們的功能特性，137 個(gè)差異表達(dá)基因被劃分為3 大類，主要涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞伸長(zhǎng)等調(diào)節(jié)過(guò)程。32 個(gè)unigene 與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)通路有關(guān)，包括生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Auxin sig?naling pathways），茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Jasmonic acid signaling pathways），細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Cytokinin signaling pathways），赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Gibberellic acid signaling pathways），乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Ethylene signaling pathways），脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Abscisic acid signaling pathways）等（見圖6），其中生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)通路所含的差異表達(dá)基因數(shù)量最多，有14個(gè)，其次是乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路，含6 個(gè)；67 個(gè)unigene 與細(xì)胞伸長(zhǎng)有關(guān)，主要包括擴(kuò)張蛋白（Expansin）、水通道蛋白（Aquaporin）、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶、木糖酶（Xylosi?dase）、纖維素合成酶（Cellulose synthase）、果膠酯酶（Pectin esterase）、果膠酶（Polygalacturonase）、果膠裂解酶（Pectate lyase）、谷氧還蛋白（Glutaredox?in）、GDSL 脂酶/脂肪酶（GDSL esterase/lipase），其中果膠酯酶所含unigene 的數(shù)量最多（見圖7）。而與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用有關(guān)的unigene有38個(gè)，轉(zhuǎn)錄因子主 要 有MYB、Zinc finger protein、AP2/EREBP、MADS、bHLH 等5 個(gè)類型，其中Zinc finger protein和MYB 轉(zhuǎn)錄因子所含數(shù)量較多，分別有12、11 個(gè)（見圖8）。此外，對(duì)調(diào)控開花網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，如CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）、FLOWERING LOCUS D（FD）、SHORT VEGETA?TIVE PHASE （SVP）、FLOWERING LOCUS C（FLC）、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）、LEAFYL（LFY）、APETALA 1（AP1）、APETALA 2（AP2）、TERMINAL FLOWER 1（TFL1）、APETALA 3（AP3）、PISTILLATA（PI）、AGAMOUS（AG）、SHATTERPROOF 1（SHP1）、SEPALLATA 3（SEP3）的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要在花瓣發(fā)育的早期階段表達(dá)，且表達(dá)量不高，成花素基因FT 基本不表達(dá)；調(diào)控花瓣發(fā)育的相關(guān)基因AP3、PI、SEP3 中度表達(dá)，表達(dá)變化水平類似（見圖9）；其中只有AG、SHP1為差異表達(dá)基因，這兩個(gè)基因均是在花瓣發(fā)育早期表達(dá)，后期不表達(dá)，它們可能參與了金花茶花瓣早期發(fā)育的調(diào)控。

2.4 金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)基因的趨勢(shì)分析

對(duì)1 922 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因可聚類為20 種基因表達(dá)模式，其中1 349 個(gè)差異表達(dá)基因在profile16、profile19、pro?file18、profile0、profile5等5個(gè)基因表達(dá)模式中達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），每個(gè)profile 所包含的差異表達(dá)基因數(shù)量分別為465、345、190、187、162個(gè)；此外，基因表達(dá)模式Profile19 和Profile0 的變化趨勢(shì)相對(duì)簡(jiǎn)單，Profile19 為持續(xù)上調(diào)表達(dá)，Profile0 為逐步下調(diào)表達(dá)；其余3個(gè)基因表達(dá)模式的變化趨勢(shì)相對(duì)復(fù)雜，Profile16、Profile18 為先上調(diào)再下調(diào)表達(dá)模式，但兩者的基因上調(diào)表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)以及基因下調(diào)表達(dá)程度存在差別，而Profile5 為先下調(diào)再上調(diào)，表達(dá)維持穩(wěn)定一段時(shí)間后，再進(jìn)行下調(diào)的基因表達(dá)模式（見圖10）。對(duì)金花茶花瓣差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢(shì)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因存在多種表達(dá)模式，表明在金花茶花朵開放以及花瓣發(fā)育中存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。結(jié)合趨勢(shì)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)篩選獲得的部分unigene 在金花茶花朵開放及花瓣發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，它們的變化趨勢(shì)與4 個(gè)比較組中差異表達(dá)基因的變化趨勢(shì)基本相符（見圖11）。在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞伸長(zhǎng)等3個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程中，持續(xù)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的unigene 數(shù)量分別為9 個(gè)、12 個(gè)和27 個(gè)，且持續(xù)上調(diào)的unigene 多于下調(diào)表達(dá)的unigene 數(shù)量。在果膠酯酶、鋅指蛋白和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)通路中，含有持續(xù)上調(diào)的unigene 較多，而持續(xù)下調(diào)表達(dá)的unigene 主要集中在AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶基因家族、茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)通路中，這些相關(guān)的unigene可能在調(diào)控金花茶花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要作用。

2.5 金花茶花瓣中高表達(dá)基因功能分析

為研究高表達(dá)基因在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中的功能，將FPKM 均值大于100 的unigene 認(rèn)為是高表達(dá)基因。在金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組的unigene中，共有334個(gè)高表達(dá)的unigene，其中有31個(gè)為差異表達(dá)基因。對(duì)高表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些unigene具有不同的表達(dá)方式（見圖12），其中大部分unigene 只在花瓣發(fā)育的單個(gè)時(shí)期高表達(dá)，少數(shù)unigene 可在花瓣發(fā)育的早期（S1）和后期（S5）高表達(dá)。對(duì)高表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，共有7條KEGG 代謝通路的富集達(dá)到了極顯著水平（Q<0.05），具體的通路為類黃酮生物合成（ko00941），植物晝夜節(jié)律（ko04712），吞噬體（ko04145），苯丙素生物合成（ko00940），核糖體（ko03010），戊糖和葡萄糖醛酸鹽轉(zhuǎn)化（ko00040），光合生物的固碳作用（ko00710）（見圖13）；此外，20%的高表達(dá)unigene富集到了新陳代謝通路途徑（ko01100），雖然該通路的富集程度未到達(dá)顯著水平。KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金花茶花瓣高表達(dá)基因的功能主要與次生物質(zhì)合成、植物晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)有關(guān)。

2.6 金花茶差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性，將18S rRNA 作為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取3 個(gè)差異表達(dá)基 因Contig18624_g1、TRINITY_DN207944_c2_g1和TRINITY_DN188579_c0_g2 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析，它們分別被注釋為絲氨酸羧肽酶（Ser?ine carboxypeptidase）、番茄紅素-環(huán)化酶（Lycopenecyclase）、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶（見圖14～16）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，在金花茶花瓣發(fā)育中3 個(gè)DEG 表達(dá)量的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本符合，即這些unigene 在金花茶花瓣發(fā)育早期（S1、S2、S3）中低度表達(dá)，在花瓣發(fā)育后期（S4、S5）高度表達(dá)。金花茶花瓣的熒光定量PCR 數(shù)據(jù)表明花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性較高。

3 討論

花瓣是高等植物生殖系統(tǒng)的重要組成部分，除了保護(hù)雄蕊和雌蕊，花瓣的大小、形狀、顏色和排列等特征，還可以吸引傳粉昆蟲，保證授粉的成功?；ò晟L(zhǎng)的基本程序，始于花瓣原基的形成，隨后進(jìn)入到細(xì)胞增殖時(shí)期，然后再通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)展和分化，形成成熟花瓣器官［24］，而花瓣細(xì)胞擴(kuò)展過(guò)程中會(huì)發(fā)生細(xì)胞膨壓改變、細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞壁物質(zhì)降解及重新合成等生理活動(dòng)［25］。雙子葉植物花瓣的細(xì)胞壁主要由木葡聚糖和纖維素構(gòu)成，并通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行交聯(lián)。花瓣發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞增大依賴于內(nèi)糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、水解酶、擴(kuò)展蛋白和這些酶的共同作用［26］。對(duì)金花茶花瓣4 個(gè)比較組中差異表達(dá)基因的GO 富集分析結(jié)果與上述觀點(diǎn)相符，金花茶開花過(guò)程中GO 分類表明差異表達(dá)基因主要與纖維素代謝，葡聚糖合成與分解，化學(xué)鍵生成與斷裂，生物膜的合成以及電子載體活性有關(guān)；另外，發(fā)現(xiàn)許多對(duì)細(xì)胞增大有促進(jìn)作用的水解酶、聚半乳糖醛酸酶、轉(zhuǎn)移酶都被富集到了GO 分類中，并且達(dá)到了顯著水平；其中二級(jí)GO 分類單元催化活性（GO：0003824），它所含有的三級(jí)GO 分類單元水解酶（GO：0016787）、四級(jí)GO 分類單元糖基鍵水解酶（GO：0016798）、五級(jí)GO 分類單元水解O-糖基化合物水解酶（GO：0004553）均表現(xiàn)為顯著富集，這些分類單元包含的unigene 以木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（XTH）為主，該蛋白為多基因家族，在植物細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中XTH 是植物細(xì)胞壁重構(gòu)過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，不但可以松弛和合成細(xì)胞壁，還能強(qiáng)化細(xì)胞壁；另外還具有降解細(xì)胞壁的功能［27～28］。而金花茶花瓣4 個(gè)比較組中差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在次生物質(zhì)代謝、激素合成與傳導(dǎo)、糖類和脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化等代謝通路中，而在深山含笑（Michelia maudiae）［29］、薰衣草（Lavandula an?gustifolia）［30］、茶 樹（Camellia sinensis）［31］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［32］等其他植物的花瓣富集分析中，也存在類似的結(jié)果。

對(duì)金花茶花瓣的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，共獲得10 大類與花瓣發(fā)育有關(guān)的下游功能基因，其中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（XTH）、果膠酯酶（PE）等功能基因所占比例較大，驗(yàn)證了金花茶花瓣中差異表達(dá)基因GO 富集分析的結(jié)果。本研究鑒定出了9 個(gè)XTH 基因，在金花茶花朵開放過(guò)程中，它們的表達(dá)變化趨勢(shì)存在一定差異，其中4 個(gè)XTH unigene 在花朵開放過(guò)程中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而另外3個(gè)則持續(xù)下調(diào)。與擬南芥、月季、康乃馨等XTH 基因的表達(dá)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)金花茶XTH 基因的表達(dá)量、表達(dá)部位與上述植物不盡相同。 如TRINITY_DN185804_c2_g1 被 注 釋 為AtXTH33，主要在金花茶成熟花瓣中高表達(dá)，而擬南芥AtXTH33 在花發(fā)育中期的花藥中進(jìn)行表達(dá)。Contig15598_g1 和TRINITY_DN193129_c4_g1 這兩個(gè)unigene被注釋為AtXTH2，TRINITY_DN20353 9_c1_g3 被注釋為AtXTH3，在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中它們持續(xù)下調(diào)表達(dá)，但在玫瑰花中的RbXTH2能被乙烯誘導(dǎo)表達(dá)，在花瓣脫落中具有促進(jìn)細(xì)胞分離的功能［33］；在擬南芥中AtXTH3 在絨氈層細(xì)胞壁中專一性表達(dá)，可降解絨氈層細(xì)胞壁［34～36］；而在康乃馨中DcXTH2 和DcXTH3 基因卻在開放的花瓣中大量表達(dá)，很可能促進(jìn)了花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育［37］。根據(jù)unigene 表達(dá)量的變化情況進(jìn)行推測(cè)，在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量趨勢(shì)上調(diào)的4 個(gè)XTH 基因可能起到了正調(diào)控作用；而表達(dá)量趨勢(shì)下調(diào)的基因可能具有負(fù)調(diào)控作用，但其具體功能仍需進(jìn)一步研究。

研究中還發(fā)現(xiàn)，在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中，有6條激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路含有差異表達(dá)基因；這些差異表達(dá)基因主要分布在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等3條植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)植物從胚胎發(fā)生到成熟的生長(zhǎng)進(jìn)程中具有決定性作用［38］，而本研究中金花茶花瓣的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路含有的差異表達(dá)基因數(shù)量最多，共有14 條；其中1 條unigene 被注釋為AUX1 共轉(zhuǎn)運(yùn)體（AUX1/LAX），6 條unigene被 注 釋 為AUX/IAA 基 因，7 條unigene 被 注 釋 為SAUR 基因，AUX1/LAX 是生長(zhǎng)素運(yùn)入載體，AUX/IAA 和SAUR 基因都屬于生長(zhǎng)素早期反應(yīng)基因，它們對(duì)生長(zhǎng)素起重要調(diào)節(jié)作用。此外，還發(fā)現(xiàn)注釋為AUX/IAA 和SAUR 的unigene 主要在完全開放的成熟花瓣中高表達(dá)，有5 條unigene 的表達(dá)量隨花瓣發(fā)育持續(xù)上調(diào)表達(dá)，根據(jù)參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)量推斷，它們可能在決定和維持花瓣中發(fā)揮著積極的作用。該結(jié)果與Han 等在月季花瓣發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組研究［12］以及花瓣近軸面和遠(yuǎn)軸面細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果類似［39］，月季花瓣發(fā)育中生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也存在大量高表達(dá)的差異表達(dá)基因。金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也存在較多的差異表達(dá)基因；有研究表明，生長(zhǎng)素與乙烯可以協(xié)同作用，調(diào)節(jié)根的伸長(zhǎng)、葉片發(fā)育和許多其他生理過(guò)程［40～41］。金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中是否存在生長(zhǎng)素與乙烯協(xié)同作用，調(diào)節(jié)花瓣發(fā)育，這個(gè)問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

在金花茶花瓣發(fā)育的各個(gè)階段，表達(dá)水平具有較大變化的轉(zhuǎn)錄因子有MYB、bHLH、AP/EREBP、MADS、Zinc finger protein。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中最豐富的類群，具有調(diào)節(jié)植物發(fā)育、次生代謝物質(zhì)合成、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強(qiáng)植物抗性等作用［42］。本次金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組分析，也發(fā)現(xiàn)了許多MYB 轉(zhuǎn)錄因子，其中TRINI?TY_DN182693_c0_g1 和TRINITY_DN197357_c2_g 3，這兩個(gè)unigene 分別被注釋為AtMYB17 和At?MY105。此前有研究報(bào)導(dǎo)，擬南芥AtMYB17 主要在莖尖、幼嫩的花蕾、發(fā)育的心皮和纖毛［43］、花分生組織中表達(dá)，可使植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，起始花原基的生成及促進(jìn)植物開花［44］；金花茶中TRINITY_DN182693_c0_g1 只在幼嫩的花蕾期（S1）高表達(dá)，與擬南芥AtMYB17 在花組織中的表達(dá)特征類似，但其是否具有促進(jìn)植物成花轉(zhuǎn)變的功能仍有待深入研究。而擬南芥AtMYB105 主要在植物器官的邊緣表達(dá)，具有調(diào)控側(cè)生器官的發(fā)育及形成、腋生分生組織發(fā)育的功能［45］，與At?MYB105 同源的基因TRINITY_DN197357_c2_g3在金花茶開放的前四個(gè)時(shí)期中度表達(dá)，因此推測(cè)該基因?qū)τ诰S持金花茶花瓣的形狀及大小，可能具有重要的調(diào)節(jié)功能。此外，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子的TRINITY_DN194462_c2_g2 和Contig2515_g1，被注釋為AtBPE（BIGPETAL）基因，它們?cè)诮鸹ú杌ò臧l(fā)育的不同階段中低度表達(dá)；目前，已有研究表明擬南芥的BPEp 基因主要在花瓣中特異性表達(dá)，其突變體的花瓣表面積比野生型更大，該基因可抑制細(xì)胞體積擴(kuò)增來(lái)調(diào)控花瓣形狀的大?。?6］；根據(jù)這兩個(gè)unigene 的表達(dá)量及其同源基因的已知功能，推測(cè)它們可能在調(diào)控金花茶花瓣大小上具有重要作用。

本研究對(duì)金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分unigene 只在花瓣發(fā)育的單個(gè)時(shí)期高表達(dá)，因此推斷這些unigene 主要在特定時(shí)期來(lái)調(diào)控金花茶花瓣的發(fā)育；高表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金花茶花瓣高表達(dá)基因主要與次生物質(zhì)合成有關(guān)，該結(jié)論與金花茶花瓣中差異表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果類似。這些在花瓣中高表達(dá)的基因和差異表達(dá)基因可能對(duì)金花茶花瓣內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成具有調(diào)控利用。在金花茶花瓣轉(zhuǎn)錄組的高表達(dá)基因中，有31個(gè)為差異表達(dá)基因，與花瓣發(fā)育有關(guān)的unigene 有TRINITY_DN190714_c3_g1、TRINITY_DN210333_c3_g6、TRINITY_DN198980_c0_g7，它們分別被注釋為GDSL 酯酶/脂肪酶、果膠酯酶、果膠裂解酶；另外，高表達(dá)基因中與花瓣發(fā)育調(diào)控的基因主要涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞伸長(zhǎng)等3個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程，與細(xì)胞伸長(zhǎng)有關(guān)的功能基因主要是水通道蛋白（Aquaporin protein，AQP）。植物水通道蛋白是重要的多功能膜蛋白，在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、種子萌發(fā)、蒸騰作用、光合作用、氣孔調(diào)節(jié)及抗逆應(yīng)答等過(guò)程中起重要作用［47］。目前，Ma 等已研究證實(shí)月季的水通道蛋白R(shí)hPIP2；在花瓣表皮細(xì)胞中高度表達(dá)，表達(dá)模式與開花周期類似，該蛋白具有促進(jìn)花瓣細(xì)胞擴(kuò)張，使花瓣伸長(zhǎng)的功能［48］。綜合水孔通道蛋白在金花茶花瓣中的高表達(dá)量及其同源基因的已知功能，推測(cè)水孔通道蛋白，特別是被注釋為PIP 類型水通道蛋白的unigene（TRINI?TY_DN208396_c4_g1），可能在調(diào)控金花茶花瓣形狀上具有重要作用。

植物開花是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)變化的過(guò)程，主要分為成花決定、花的發(fā)端、花器官發(fā)育等3個(gè)階段［49］，由開花調(diào)控相關(guān)基因CO、FT、SOC1、LFY、AG、TFL1、SEP3、AP1 等組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行精細(xì)的控制［50-52］；花器官發(fā)育的ABCDE 模型中，主要由A類基因（AP1）、B類基因（PI，AP3）、E類基因（SEP）調(diào)控花瓣的形成［53］，當(dāng)這些基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致花瓣的錯(cuò)位發(fā)育［54］。本次實(shí)驗(yàn)選取了花瓣原基形成后不斷伸長(zhǎng)的花瓣作為研究對(duì)象，對(duì)調(diào)控花瓣形成相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)金花茶的PI、AP3、SEP 基因表達(dá)水平相似，而B 類基因AP3、PI 結(jié)合為異源二聚體后，才能和SEP/AP1 形成四聚體決定花瓣的發(fā)育［55］，因此推測(cè)蛋白之間的互作，使PI、AP3、SEP 等基因的表達(dá)水平類似。模式植物的研究表明，調(diào)控花器官發(fā)育的MADS-box 基因的功能與其表達(dá)模式高度相關(guān)，所以在非模式植物中，可以利用MADS-box 基因表達(dá)模式對(duì)它們的功能來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)［56］。此外，Sablowski等發(fā)現(xiàn)AP3/PI的異源二聚體可以直接調(diào)節(jié)NAP（NAC-LIKE，ACTIVATED BY AP3/PI）基因，而NAP 在花發(fā)育中的花瓣和雄蕊中表達(dá)，其表達(dá)與花瓣和雄蕊組織由細(xì)胞分裂到細(xì)胞膨大的轉(zhuǎn)變有關(guān)［57］；劉志雄等對(duì)大花惠蘭（Cymbidium faberi Rolfe）CyfaPI 基因功能研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化35S：：Cyfa?PI 的擬南芥中，PI/pi-1 雜合子背景下的轉(zhuǎn)基因擬南芥的一個(gè)株系產(chǎn)生了較大的花［58］，上述研究表明B類基因，如PI、AP3，對(duì)于花型及花瓣大小的調(diào)控可能起到重要的作用。金花茶的AP1、PI、AP3、SEP 基因都屬于MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中基因PI、AP3、SEP 的表達(dá)趨勢(shì)類似，它們主要在花瓣發(fā)育的早期和中期中度表達(dá)，在盛開的花瓣（S5）中不表達(dá)，因此它們可能參與了金花茶花瓣早中期發(fā)育的調(diào)控，但它們具體的調(diào)控機(jī)制仍有待揭示。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq 技術(shù)分析了金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，金花茶開花過(guò)程中差異表達(dá)基因的功能主要與糖的合成、分解與代謝、酶的活性與催化、化學(xué)鍵的生成與斷裂、生物膜的合成以及電子載體活性有關(guān)。KEGG富集分析結(jié)果表明，金花茶花瓣差異表達(dá)基因的功能則主要與次生物質(zhì)代謝、激素合成與傳導(dǎo)、糖類和脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。金花茶花瓣差異表達(dá)基因涉及6條激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所含差異表達(dá)基因數(shù)量最多，部分AUX1/LAX 共轉(zhuǎn)運(yùn)體、AUX/IAA 基因、SAUR 等生長(zhǎng)素應(yīng)答基因在開花過(guò)程中明顯上調(diào)，表明生長(zhǎng)素可能對(duì)于調(diào)控金花茶花瓣發(fā)育具有重要的作用；部分轉(zhuǎn)錄因子及下游功能基因MYB、bHLH、鋅指蛋白、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等，它們的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著變化，其中XTH 顯著富集于GO分類中的水解酶活性，因此推斷這些基因可能在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。此外，本研究分析了FT、SOC1、AP3、PI、SEP3 等開花調(diào)控關(guān)鍵基因在金花茶花瓣發(fā)育過(guò)程中主要以中低表達(dá)為主。KEGG 富集分析結(jié)果表明，金花茶花瓣高表達(dá)基因主要與次生物質(zhì)合成有關(guān)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究金花茶花瓣發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。