陳華峰 樊松樂(lè) 王立豐*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，?？?571101）

赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是赤霉素和它的可溶性受 體 蛋 白GID1 結(jié) 合 時(shí)，GID1 與DELLA 蛋 白 的DELLA 和VHYNP 結(jié)合后，將阻遏蛋白DELLA 在26S 蛋白酶體水解［1］。DELLAs 是陸生植物特有的，屬于GRAS 轉(zhuǎn)錄調(diào)控子家族［2］。它是赤霉素信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子。缺失該基因的擬南芥和水稻突變體會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的表型。DELLA 功能與其結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因和蛋白互作相關(guān)［3］。在模式植物擬南芥中已經(jīng)鑒定了GAI、RGA、RGL1、RGL2 和RGL3 五個(gè)DELLA［4］。其N 端和C 端分別含有DELLA 和GRAS 超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域。在其功能研究領(lǐng)域，已證明DELLA 通過(guò)蛋白互作方式調(diào)控超過(guò)300 以上的轉(zhuǎn)錄因子［2］。擬南芥DELLA 蛋白與MYB21 和MYB24 結(jié)合調(diào)控花絲伸長(zhǎng)［5］。FKF1 蛋白負(fù)調(diào)控DELLA 蛋白穩(wěn)定性促進(jìn)開花［6］。油菜BnaA6.RGA 與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子ABF綜和調(diào)控干旱抗性［7］。鑒于DELLA 蛋白的重要性，研究人員相繼從海棠［8］，蘋果［9］等果樹，大戟科（Euphorbiaceae）植物珍珠黃楊［10］和蓖麻［11］中克隆并鑒定了DELLA蛋白基因并驗(yàn)證其功能。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）起源于南美亞馬遜流域，是重要工業(yè)原料天然橡膠的主要來(lái)源［12］。橡膠樹生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量與植膠區(qū)環(huán)境和植物激素信號(hào)密切相關(guān)［13］。隨著分子生物學(xué)在橡膠樹研究領(lǐng)域的不斷拓展，橡膠樹中植物激素信號(hào)的調(diào)控作用機(jī)制不斷更新。如揭示橡膠樹ABA信號(hào)途徑的PP2A 家族［14］，bZIP［15］。生長(zhǎng)素信號(hào)HbJAR1［16］和乙烯信號(hào)AP2/ERF［17］等。在橡膠樹赤霉素信號(hào)研究領(lǐng)域，已經(jīng)鑒定了HbGAI 基因，并證明其受割膠、茉莉酸甲酯和乙烯利差異調(diào)控表達(dá)。在RGL1 的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)RGL1 與WRKY45互作激發(fā)葉片衰老［18］。鑒于DELLA 蛋白植物生長(zhǎng)發(fā)育和激素信號(hào)交互中的作用，揭示并證明橡膠樹中DELLA 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能將為研究生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。據(jù)此，本研究克隆并鑒定HbRGA1 的cDNA 全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和特性，并利用熒光定量PCR 技術(shù)分析該基因的表達(dá)模式，為闡明HbRGA1在橡膠樹的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所儋州基地國(guó)家種質(zhì)資源圃種植巴西橡膠樹主推品種Rey?an73397 正常割膠的10 年樹齡的莖、葉、膠乳、樹皮為材料，用于HbRGA1 的克隆、不同組織的表達(dá)分析。白粉病、機(jī)械傷害、赤霉素、干旱、脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素和乙烯利處理參照文獻(xiàn)方法［19～20］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橡膠樹葉片提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

參照TIANGEN 植物總RNA 提取試劑盒的方法，提取巴西橡膠樹不同組織和不同處理樣品的總RNA，RNA 的濃度與純度通過(guò)Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析儀（Gene Company Limited，上海）檢測(cè)，后利用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒發(fā)轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA 為模板利用PCR 擴(kuò) 增 內(nèi) 參 基 因 HbACTIN（Genbank：HQ260674.1）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 HbRGA1 cDNA全長(zhǎng)序列的克隆

根據(jù)橡膠樹數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）以熱研73397 的cDNA 為模板，利用PCR 擴(kuò)增HbRGA1 的全長(zhǎng)序列，使用OMEGA 膠回收試劑盒并參考使用說(shuō)明對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD-18T 載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測(cè)后挑取陽(yáng)性克隆送去賽默飛世爾公司測(cè)序。

表1 HbRGA1全長(zhǎng)擴(kuò)增和熒光定量引物序列Table 1 Primer sequences of full-length cloning and qRTPCR of HbRGA1

1.2.3 HbRGA1生物信息學(xué)分析及進(jìn)化分析

利用在線工具SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信號(hào)肽，TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，PSIPRED V4.09 （https：//github. com/psipred/psipred）預(yù) 測(cè) 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)，SMART：Main page（http：//smart. embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）分析保守結(jié)構(gòu)域，Prot?Param（https：//web.expasy.org/protparam/）工具對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析。MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線分析軟件對(duì)與HbRGA1同源性較高的序列經(jīng)行motif預(yù)測(cè)分析。使用DNAMAN9 軟件經(jīng)行多序列對(duì)比及同源相似性。使用MEGAX 軟件并使用鄰接法（neigh?bor-joining）經(jīng)行系統(tǒng)發(fā)育分析（bootstrap 值設(shè)為1 000）。

1.2.4 不同處理下HbRGA1表達(dá)分析

根據(jù)HbRGA1 編碼蛋白序列設(shè)計(jì)熒光定量引物（見(jiàn)表1），選用橡膠樹HbACTIN 基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBR Green 法在伯樂(lè)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量PCR 檢測(cè)，熒光定量PCR 反應(yīng)體系和程序參考前人方法［21］。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，IBM SPSS Statistics進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)分析差異顯著性，Origin Pro2018（Origin Lab Corporation，Massachusetts，USA）軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRGA1的克隆與生物信息學(xué)分析

以橡膠樹葉片cDNA 為模板，通過(guò)PCR 克隆得到HbRGA1 cDNA 全長(zhǎng)序列，測(cè)序驗(yàn)證正確無(wú)誤后，并將cDNA 序列命名為HbRGA1 并提交NCBI（GenBank：KM086713）。其長(zhǎng)度2 136 bp，包含1 839 bp的ORF。HbRGA1基因編碼區(qū)的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列，共編碼613 個(gè)氨基酸殘基，在49-115是特征性的DELLA蛋白結(jié)構(gòu)域，在254-610處是GRAS 結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖1A）。通過(guò)在線分析工具SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析預(yù)測(cè)HbRGA1 存在信號(hào)肽的概率是0.002（見(jiàn)圖1B），說(shuō)明其不含信號(hào)肽。利用在線分析 工 具PSIPRED V4.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)HbRGA1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖3A）發(fā)現(xiàn)存在許多Alpha Helix 和Random coil 結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/in?teractive）在線分析工具分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合（見(jiàn)圖1B）。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（見(jiàn)表1），證明其實(shí)疏水性蛋白。HbRGA1 與毛果楊PtPOPTR（Populus tricho?carpa，XP_002305198），蓖麻RcGAI（Ricinus com?munis，XP_002534030），胡 楊PeGAI（Populus eu?phratica，XP_011002785），蘋果MdGAI-like（Malus domestica，XP_008343058），橡膠樹HbGAI（Hevea brasiliensis）進(jìn)行同源性分析，總相似度達(dá)到82.5%9（見(jiàn)圖2）。進(jìn)化分析表明HbRGA1 與橡膠樹HbGAI 聚為一類（見(jiàn)圖3A）。TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析預(yù)測(cè)HbRGA1 無(wú)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，利用在線分析工具DeepLoc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預(yù)測(cè)HbRGA1 蛋白亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核中的概率為0.998（見(jiàn)圖3B）。利用MEME 在線分析軟件分析橡膠樹HbRGA1 與其他植物DELLA 蛋白序列有3 個(gè)共同的motif（見(jiàn)圖3C）且標(biāo)注了其在相關(guān)序列的位置，motif序列與生物功能密切相關(guān)。

表2 橡膠樹HbRGA1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Table 2 Physical properties of HbRGA1 from H. brasil‐iensis

2.2 HbRGA1的表達(dá)分析

通過(guò)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HbRGA1 在橡膠樹樹皮、葉片、膠乳和花中均有表達(dá)，其中在葉片和花中的表達(dá)量較高，葉片的表達(dá)量是膠乳中的8倍左右。在樹皮和膠乳中HbRGA1的表達(dá)量相對(duì)較低（見(jiàn)圖4）。據(jù)此，我們以橡膠樹芽接苗為材料進(jìn)一步分析了在干旱和不同激素處理下的表達(dá)規(guī)律。從圖4可以看出，隨著白粉病級(jí)別的提高，HbRGA1 的表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢(shì)。機(jī)械傷害處理的葉片，HbRGA1 的表達(dá)量分別在1 和10 h 達(dá)到兩個(gè)峰值，分別為初始0.5 h 的4 和6 倍。赤霉素處理后，HbRGA1的表達(dá)量在0.5 h就上調(diào)接近12倍，隨后呈現(xiàn)下降的規(guī)律。

在干旱條件下，HbRGA1 基因的表達(dá)量在3 d顯著性上升，達(dá)到對(duì)照的6 倍，之后表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)。在ABA 作用下，HbRGA1 基因的表達(dá)量在0.5～10 h 顯著性上調(diào)且在10h 達(dá)到最高點(diǎn)，之后下調(diào)，但仍高于處理前的水平。水楊酸處理后，HbRGA1 的表達(dá)量在10～48 h 長(zhǎng)時(shí)間保持峰值，隨后下調(diào)。茉莉酸甲酯處理后，HbRGA1 的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，在6 h 達(dá)到峰值，表達(dá)量是對(duì)照的6 倍。生長(zhǎng)素處理后，HbRGA1 的表達(dá)量在6～48 h 呈現(xiàn)峰值，表達(dá)量是對(duì)照的6 倍。乙烯利噴施處理的葉片中，HbRGA1 基因的表達(dá)量在6 h呈現(xiàn)峰值，隨后急劇下調(diào)并趨于穩(wěn)定（見(jiàn)圖5）。

3 討論

3.1 HbRGA1是植物DELLA蛋白家族成員

DELLA 蛋白是植物赤霉素信號(hào)的轉(zhuǎn)錄遏制因子，含有特征性的DELLA 和GRAS 超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域。DELLA 結(jié)構(gòu)域的序列為DELLAVLGYKVRSSDMADVAQKLEQLEMVMGTAQEDGISYLCSDT ?VHYNPSDLSGWVQSMLSELNPPMCLDASG，在 所有植物物種中均保守，DELLA 和VHYNP這兩個(gè)基序是赤霉素信號(hào)受體GID1 蛋白的結(jié)合區(qū)域。采用缺段突變技術(shù)，將RGA 基因的DELLAVL?GYKVRSSEMA 敲除后，突變體擬南芥表現(xiàn)出GAI一樣的表型，說(shuō)明DELLA 結(jié)構(gòu)域是DELLA 蛋白行駛功能的重要區(qū)域［22］。DELLA 蛋白家族的另外一個(gè)結(jié)構(gòu)域是GRAS 也具有DELLA 蛋白的功能，在缺失DELLA 結(jié)構(gòu)域的突變體發(fā)揮部分替代功能［23～24］。本研究發(fā)現(xiàn)，我們克隆的HbRGA1蛋白分別在49-115 是特征性的DELLA 蛋白結(jié)構(gòu)域，在254-610 處是GRAS 結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖1A），并與其他植物已知的DELLA 蛋白相似度達(dá)82.5%以上（見(jiàn)圖2），并與橡膠樹HbGAI 蛋白聚在一起，說(shuō)明HbRGA1是植物DELLA 蛋白家族中一員。亞細(xì)胞定位顯示其定位在細(xì)胞核，與F-box 蛋白SLY1 和GID1蛋白等互作［25］。

3.2 HbRGA1 在橡膠樹植物激素信號(hào)交互中具有重要作用

盡管DELLA 蛋白最早是在赤霉素激素信號(hào)研究中發(fā)現(xiàn)的，但其被證明參與多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和其他植物激素信號(hào)途徑［26～27］。例如，擬南芥中乙烯通過(guò)調(diào)控DELLA 抑制赤霉素生長(zhǎng)效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育［28］。生長(zhǎng)素單獨(dú)調(diào)控DELLA 蛋白進(jìn)而調(diào)控赤霉素水平［29］。在茉莉酸信號(hào)中，DELLA 蛋白通過(guò)與茉莉酸信號(hào)阻遏子JAZ蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合參與調(diào)控茉莉酸信號(hào)［30］。在植物逆境抗性，冷害誘導(dǎo)因子CBF1 通過(guò)調(diào)控DELLA蛋白含量調(diào)控赤霉素代謝［31］。遠(yuǎn)紅光通過(guò)DELLA蛋白刺激的ABA合成抑制萌發(fā)［32］。這與本研究的結(jié)果一致。在單獨(dú)逆境和激素處理下，都能上調(diào)HbRGA1 的表達(dá)量。其中，赤霉素誘導(dǎo)效果最早，在0.5 h 達(dá)到峰值（見(jiàn)圖4）。干旱、水楊酸和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)效應(yīng)最久，可達(dá)2～3 天（見(jiàn)圖5）。這說(shuō)明，HbRGA1 在橡膠樹中可能參與多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的交互。這與前人的研究結(jié)果一致，如HbGAI 受茉莉酸甲酯和乙烯利誘導(dǎo)差異表達(dá)［33］。蓖麻RcGAI 在葉片中表達(dá)量高［34］。下一步擬采取構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因，基因編輯［35］和免疫印跡技術(shù)鑒定hbRGA1的互作蛋白和功能［36］。

3.3 HbRGA1 在橡膠樹排膠機(jī)理與調(diào)控技術(shù)研究中的應(yīng)用

巴西橡膠樹膠乳來(lái)自于位于巴西橡膠樹韌皮部的乳管細(xì)胞，里面含有線粒體、質(zhì)體等細(xì)胞器，具有割膠后膠乳再生的作用。不同品種具有不同的排膠特性［37］。這些排膠特性的差異是由于里面的差異基因表達(dá)決定的［37］。挖掘橡膠排膠的關(guān)鍵功能基因及相關(guān)分子標(biāo)記是天然橡膠產(chǎn)業(yè)亟待解決的理論和技術(shù)問(wèn)題。目前，已經(jīng)證明乙烯通過(guò)延長(zhǎng)排膠時(shí)間促進(jìn)膠乳產(chǎn)量提升［39］是由于Hev b 7-like 蛋白起到的去凝集作用［40］。作為赤霉素和乙烯激素信號(hào)交互的重要調(diào)控蛋白［28］，DELLA 蛋白精細(xì)的調(diào)控兩種激素介導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，HbRGA1 在赤霉素處理前期0.5 h 高表達(dá)，隨后顯著下調(diào)表達(dá)。乙烯利處理在6 h 顯著上調(diào)HbRGA1 表達(dá)。表明激素信號(hào)可能通過(guò)時(shí)間或空間差異調(diào)控DELLA 蛋白基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控阻遏蛋白含量，抑制赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。可采用分析不同品種、不同排膠時(shí)間的膠乳代謝組和蛋白組聯(lián)合分析鑒定HbRGA1 在橡膠樹排膠過(guò)程中的作用，為研發(fā)排膠調(diào)控技術(shù)提供指導(dǎo)。