陳 芳 佘婷婷 張 琳 高浩天 李國梁 王 健，*

（1. 安康學院現(xiàn)代農業(yè)與生物科技學院，安康 725000；2. 陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021；3. 教育部藥用植物資源與天然藥物化學重點實驗室和西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，西安 710062）

MicroRNA（miRNA）是一類長度約為22 個核苷酸的內源單鏈非編碼RNA，主要通過切割靶基因mRNA 或抑制靶mRNA 翻譯來調控植物個體生長發(fā)育、代謝和環(huán)境脅迫應答等生理過程［1］。隨著在模式植物中對miRNA調控次生代謝途徑的研究逐漸深入，越來越多的證據顯示miRNAs 在植物，尤其是某些經濟類作物以及藥用植物次生代謝途徑中發(fā)揮著至關重要的調控作用。例如，在擬南芥體內，miR156通過對其靶標基因SPL9的下調進而調控花青素、黃酮醇以及倍半萜等活性成分的含量［2～3］；miR159a 通過下調黃酮醇合酶（Flavonol synthase）基 因 調 控 花 青 素、黃 酮 醇 的 合 成［4］；miR828 通過觸發(fā)ta-siRNAs 的形成下調R2R3-MYB 轉錄因子基因PAP1、PAP2 以及MYB113 的表達進而廣泛調控花青素的合成［5］。在其他植物中，如蘋果中miR858通過對其靶標MYB基因家族的下調調控花青素以及原花青素的代謝；紅豆杉中miR164 和miR171 對其體內紫杉烷二萜生物合成的調控［6］；長春花中miR5021 以及棉花中miR8156和miR8170對萜類吲哚生物堿合成的調控［7～8］。

丹參是我國傳統(tǒng)大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖。近年來，隨著對丹參體內次生代謝合成調控研究的逐漸深入，丹參被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想材料。丹參體內活性成分酚酸類化合物由酪氨酸代謝途徑和苯丙烷類代謝途徑兩條支路共同參與而成［9］。在植物次生代謝途徑中，MYB 類轉錄因子已被證實廣泛參與苯丙烷類代謝途徑的調控［10］。目前對丹參酚酸類化合物生物合成途徑調控機制的研究主要側重于探討相關轉錄因子參與關鍵酶基因表達的調控，而轉錄因子自身表達調控的研究報道較為少見。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，與對照株系相比，丹參SmPAP1特異性基因沉默轉化株系中酚酸類化合物合成途徑中酶基因以及丹酚酸B 等酚酸類活性含量均呈現(xiàn)不同程度的下調［11］。由此推測SmPAP1 作為一個重要的轉錄因子，參與丹參酚酸類活性物質的代謝調控，但目前關于丹參體內SmPAP1的表達調控機制尚不清楚。

鑒于此，研究選取實驗室前期通過對丹參Small RNA 高通量測序獲得的一條成熟miR858（命名為Sm-miR858）為對象，首先通過Small RNA Northern blotting 實驗驗證該Sm-miR858 序列的真實性，然后基于在線軟件預測Sm-miR858 的靶標基因，并通過Real-time PCR 分析Sm-miR858 和潛在靶標SmPAP1之間表達水平的負相關性，再通過煙草瞬時表達體系驗證Sm-miR858 的表達量對SmPAP1 表達水平的影響，明確丹參體內存在的Sm-miR858對SmPAP1的靶向負調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究所用的植物丹參和煙草幼苗均來自于本實驗室的培養(yǎng)。用于構建Sm-miR858 和Sm-PAP1植物表達載體的pCambia1302，大腸桿菌DH5α 和根癌農桿菌EHA105 均來自本實驗室。用于overlapping PCR 模板的質粒pRSC300（weigel@weigel?world.org.）由中科院遺傳所友情贈送提供。cDNA反轉錄試劑盒Primer ScriptTMRT Reagent Kit、One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 購自中國大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體的構建及其在煙草葉片中的瞬時表達

對于Sm-miR858 植物過表達載體的構建，首先利用在線軟件WMD（http：//wmd3.weigelworld.org/）設計用于over-Lapping PCR 的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ引物（見表1），然后以質粒pRSC300為模板進行擴增，使其形成合適、對應于載體中擬南芥miR319a與miR319a*之間的“莖環(huán)”狀二級結構，over-Lap?ping PCR 所采用的方法和步驟均嚴格按照“Clon?ing of artificial microRNAs”Protocol by Rebecca Schwab操作方法進行［12］。隨后以測序正確的over-Lapping PCR 產物為模板，在引物Ⅰ和Ⅲ兩端分別加上BglⅡ和BstEⅡ酶切位點以形成用于PCR 的上游引物（5′CATGGTNACCgaTTCATTGTCTGTTC?GACCTTA3′）和上游引物（5′CATAGATCTgaTAC?GGTCGAACAGTCAATGAT3′）對Sm-miR858 與Sm-miR858*之間的前體“莖環(huán)”狀二級結構序列進行再次擴增。其后PCR 產物的酶切及其與pCam?bia1302 的連接、重組載體對農桿菌EHA105 的轉化均參照文獻［13］所描述的方法進行，構建的SmmiR858植物過表達載體命名為35S：Sm-miR858。

對于Sm-PAP1 植物過表達載體（35S：Sm-PAP1）的構建以及包含有重組目的載體農桿菌的活化、搖菌、菌液濃度值的測定、乙酰丁香酮的添加、農桿菌液對煙草葉片的注射等詳細操作步驟以及注射后煙草植物的培養(yǎng)條件和時間完全按照文獻［14］里面的操作方法進行。

1.2.2 植物RNA 的提取以及Sm-miR858 和Sm-PAP1 mRNA表達水平的檢測

實驗中植物的總RNA 提取采用鹽酸胍法，試劑配制及具體操作程序均參照Bubier 和Schlappi所述方法進行［15］。采用甲醛變性膠進行總RNA提取完整度的檢測。對于miRNA 表達豐富的檢測，為了減少DNA 的干擾，在反轉錄之前利用DNaseⅠ對所提取的總RNA 里面殘存的痕量DNA 進行去除，然后使用miRNA 加尾及反轉錄試劑盒對經過純化的總RNA 里面的miRNAs 進行polyA 加尾反應和反轉錄，詳細操作步驟均按照One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 進行。利用（5′TTCATTGTCTGTTCGACCTT3′）和 通 用 引 物Uni-miR qPCR primer （5′GACTGCGATCTCT CTTTTGTATTCC3′）作為Real-Time qPCR（RT-qP?CR）的上、下游引物，丹參及煙草的Ubiquitin 基因作為各自RT-qPCR 的內參照基因；對于Sm-PAP1表達水平的檢測，使用常規(guī)cDNA反轉錄試劑盒對經純化的總RNA 里面的mRNAs 進行反轉錄以生成cDNAs 鏈。RT-qPCR 反應程序及溫度設定參照“IQTM5 多重實時熒光定量PCR 說明”進行操作，具體引物序列見表1。

表1 Over-lapping PCR和RT-qPCR所用引物序列信息Table 1 List of primers used for Over-lapping PCR and RT-qPCR

1.2.3 Small RNA Northern blotting雜交檢測

在電泳上樣之前，首先使用50%的PEG 8000以及3.0M 的NaAc 對提取且經過完整度檢測的總RNA 進行重新沉淀、富集，以增加樣品中miRNAs的濃度。然后配制含有15%尿素的聚丙烯酰胺（PAGE）膠，灌制膠于玻璃槽上，靜置1 h 左右。將RNA 樣品用2×Small RNA 上樣緩沖液稀釋，依次將RNA 樣品加入到上樣孔中，靜置5 min。然后用150 V 的電壓跑膠1.5 h 左右直至樣品到達膠底部，再進行轉膜、交聯(lián)、預雜交、探針的標記、雜交、壓片及曝光等操作，具體操作參照Li 等操作方法［16］。實驗使用T4PNK 對探針進行P32的同位素標記以增加雜交檢測的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 Sm-miR858 序列的保守性分析及其真實性驗證

miR858 在相關植物體內的報道并不多見，截止目前，僅陸續(xù)在擬南芥、番茄、蘋果等植物中被鑒定［6，17～18］，因此，為了研究miR858的序列保守性，本實驗將Sm-miR858 和上述物種中的miR858 序列進行比對分析。結果顯示（見圖1a），7種植物中都具有“UUGUCUGUUCGACCU”這一高度保守的核心序列，但Sm-miR858 的序列長度只有20nt，其它6 種植物miR858 的序列長度均為21nt；與擬南芥miR858 相比，Sm-miR858 除了第4 個核苷酸為A 外，其它位置的核苷酸種類完全一樣；與棉花miR858 相比，Sm-miR858 從第1 個到第19 個核苷酸種類完全一樣；與其它3 個物種的miR858 序列分別存在2～3 個核苷酸的差異。序列比對結果說明，與其它已經鑒定的miR858相比，Sm-miR858具有高度的序列保守性。為了進一步驗證SmmiR858 序列在丹參體內的真實存在，本實驗以Sm-miR858 的反向互補序列為探針分別對丹參的根、莖和葉組織進行Small RNA Northern blotting 雜交驗證，同時以Sm-miR156 的Small RNA blotting雜交作為陽性對照。雜交信號結果顯示（見圖1b），Sm-miR858 在丹參的根、莖和葉組織中均有表達，葉中表達水平最高，根中次之，莖中最低，但表達水平均不高，明顯低于Sm-miR156 在上述組織中的表達水平，這與研究團隊前期丹參Small RNA 高通量測序中顯示的不同miRNAs 的Reads是高度一致的，在丹參Small RNA高通量測序結果中，Sm-miR156 有33949 個Reads，而Sm-miR858 僅僅有904 個Reads。基于Small RNA blotting 雜交結果，我們可以確認在丹參體內該Sm-miR858 序列的真實性。

2.2 丹參體內Sm-miR858靶標基因的預測

植物miRNA是通過促進靶標基因mRNA的降解或翻譯抑制來負調控靶基因的表達從而實現(xiàn)調控植物的生長發(fā)育等功能作用，因此，為了研究Sm-miR858 的功能，我們首先利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）（一款專門對植物miRNA靶標進行預測的在線分析服務器），以最新的丹參基因組編碼基因CDS 文庫為對象對Sm-miR858 的靶標基因進行預測［19］。在線分析結果顯示，Expect 值小于2.5 的靶標基因共有13 個，其中MYB 類轉錄因子基因10 個，超大鳥嘌呤核苷酸結合蛋白基因1個，另外兩個靶基因功能不詳。在這些潛在的靶標基因中，有一個R2R3-MYB類轉錄因子基因Sm-PAP1（見圖2a）。該基因是一個重要的參與丹參酚酸類活性物質代謝調控的轉錄因子基因，與其他物種中已鑒定的miR858靶標基因具有高度的相似性。為了進一步分析Sm-miR858 對靶標基因Sm-PAP1 的準確性，我們挑選了已經過實驗驗證的擬南芥和葡萄中miR858靶標基因的作用位點并與Sm-miR858的靶向作用位點進行比較分析。位點分析結果顯示（見圖2b），Sm-miR858 的靶向作用位點位于Sm-PAP1cDNA 的 第290～309 的 核 苷 酸 序 列，AtmiR858 和Vv-miR858 的靶向作用位點分別位于AtMYB104 和VvMYB114 cDNA 序列的第365～385以及第551～571 的片段，這些不同植物中miR858的靶向作用位點在核苷酸序列上具有高度的特異性（見圖2c），都編碼PGRTDNE這樣一段特異的氨基酸多肽序列（見圖2d），該多肽序列呈現(xiàn)高度的保守型，均位于R2R3-MYB 基因家族的R3 結構域內。因此，基于上述這些分析結果，我們認為在丹參體內Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標基因在理論上是可行的。

2.3 丹參體內Sm-miR858 和潛在靶標基因Sm-PAP1之間的表達相關性分析

運用生物信息學手段預測的靶基因僅是理論分析得出的結果，存在一定的假陽性。鑒于在植物生長發(fā)育過程中miRNA的表達具有高度的組織及時空特異性，不同組織中miRNA 及其靶基因共表達水平相關性分析的檢測便成為miRNA生物學功能研究的重要信息和依據。基于此，為了進一步分析丹參體內Sm-miR858 是否作用于靶標基因Sm-PAP1，利用Real-time qPCR 分別對丹參根、莖、葉及花不同組織中Sm-miR858 和SmPAP1 的組織特異性表達水平進行分子檢測。實驗結果顯示（見圖3a），與Small RNA Northern blotting 高度一致，Sm-miR858 在葉中表達水平最高，然后是花及根中，在莖中的表達水平最低，葉中的表達水平幾乎是莖中的5 倍；反觀SmPAP1 的組織表達水平（見圖3b），在莖中最高，隨后是根中，葉及花中表達水平均較低，在莖中的表達水平幾乎是葉中的4倍。二者在丹參相關各組織中的表達水平之間存在著明顯的負相關性。這種表達水平之間的負相關性實驗結果也進一步暗示，在丹參體內Sm-PAP1的表達可能被Sm-miR858靶向負調控。

2.4 Sm-miR858 靶向負調控Sm-PAP1 表達的實驗驗證

盡管通過靶標預測結果和Sm-miR858、Sm-PAP1 二者之間存在的明顯表達負相關性均表明Sm-miR858 的靶標基因是Sm-PAP1，但仍缺少直接的實驗驗證。為了進一步確認在丹參體內存在著Sm-miR858 對Sm-PAP1 基因表達的負調控關系，研究分別構建Sm-miR858 和Sm-PAP1 的植物過表達載體，利用煙草瞬時表達體系將Sm-PAP1植物過表達載體和Sm-miR858 植物過表達載體在煙草葉片細胞中進行瞬時共表達，以檢測是否存在Sm-miR858 的過表達對Sm-PAP1 的mRNA 水平進行顯著的下調。為了減少實驗的誤差，隨機選取被農桿菌菌液浸潤的3 株煙草植株相近部位的多個不同葉片進行總RNA 的提取以進行3 個生物學重復實驗，分析在不同的葉片中不同的SmmiR858 表達水平對Sm-PAP1 表達的影響。首先利用Small RNA Northern blotting 檢測了在不同煙草葉片細胞中Sm-miR858 的瞬時表達情況，以U6作為總RNA 上樣量內參，以檢驗Sm-miR858 是否能夠在煙草細胞中表達以及表達序列的真實性。雜交結果如圖4a 所示，在3 泳道中都檢測到了雜交信號，表明3 個實驗組中Sm-miR858 都有表達，證明構建的Sm-miR858 植物過表達載體中的人工莖環(huán)結構在煙草細胞中能夠被正確加工、剪切并表達；同時在陰性對照組（僅含pCambia1302 空載體）中無任何雜交信號出現(xiàn)，說明在煙草細胞中不存在與Sm-miR858 一樣的內源miRNA 序列存在。但不同實驗組中Sm-miR858 的瞬時表達水呈現(xiàn)出一定的差異，2#實驗組煙草葉片中Sm-miR858 的表達水平最高，1#組中略微降低，3#組中表達水平最低，推測造成Sm-miR858 植物過表達載體在不同實驗組煙草葉片中的表達水平不一致的原因可能跟菌液的浸潤程度不一致有關。接下來對3 個實驗組煙草組織中Sm-PAP1 及Sm-miR858 的瞬時共表達水平進行了Real-time qPCR 檢測。檢測結果顯示（見圖4b），與陰性對照組（僅含35S：Sm-PAP1 表達載體）相比，3 個實驗組中Sm-PAP1 的mRNA 水平在Sm-miR858 過表達情況下均出現(xiàn)下降，且Sm-PAP1 mRNA 水平下降的程度與SmmiR858 的表達水平呈顯著負相關性，即在2#實驗組中Sm-miR858 的表達水平最高，Sm-PAP1 的mRNA 表達水平最低；而在3#實驗組中SmmiR858 的表達水平最低，Sm-PAP1 的mRNA 表達水平相對較高，呈現(xiàn)出顯著的“劑量效應”。由于在上述煙草瞬時表達實驗結果中Sm-PAP1 的mRNA 表達水平直接受Sm-miR858 表達水平的調控，因此，可以證明Sm-PAP1 在mRNA 表達水平上確受Sm-miR858的靶向負調控。

3 討論

近年來，通過構建小RNA 文庫進行直接測序和利用生物學信息法（in silico）已經獲得了許多植物物種的不同miRNA 序列，如miR858在擬南芥和其它一些植物物種中已陸續(xù)被鑒定。然而大部分miR858 在植物體內的生物學功能仍未知，特別是在一些重要的藥用植物如丹參中的生物學功能急需研究清楚。目前對丹參酚酸類活性成分合成途徑調控機制的研究主要側重于探討相關轉錄因子參與關鍵酶基因表達調控上，而對關鍵轉錄因子自身表達調控尤其是如何被體內相關miRNA調控的研究報道較少。研究團隊前期通過對丹參Small RNA 高通量測序獲得了一條在其他植物中已經鑒定出來的miR858高度相似的miRNA 序列，命名為Sm-miR858。丹參是傳統(tǒng)大宗道地藥材，隨著對丹參體內次生代謝合成調控研究的逐漸深入，丹參已被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想研究材料。但截至目前Sm-miR858 在丹參體內的生理功能尚不清楚，本研究圍繞Sm-miR858在丹參體內的生理功能展開研究，為深入研究丹參體內次生代謝合成調控奠定基礎。

研究發(fā)現(xiàn)miR858 的靶標基因絕大多數都屬于MYB 類轉錄因子，尤其是R2R3-MYB 類轉錄因子，比如在擬南芥中4個與黃酮類合成密切相關的R2R3-MYB 被miR858 靶向調控，棉花中多達20 個R2R3-MYBs，蘋果中66 個MYBs，其中絕大多數都與苯丙烷類代謝途徑相關［6，17，20］。除了miR858 對MYB 類基因進行靶向調控外，miR828 也對一些MYB 類轉錄因子進行調控，并且作用位點均位于MYB 基因的高度保守的R3 結構域對應的核苷酸序列區(qū)。MiR858 的作用位點在miR828 作用位點的上游區(qū)，并且作用位點對應的核苷酸序列更為保守［6］。在研究miRNA 作用靶標基因預測結果中，顯示Sm-PAP1 是Sm-miR858 潛在的靶標基因。有研究表明，Sm-PAP1 是一個重要的參與丹參體內酚酸類代謝途徑調控的R2R3-MYB 類轉錄因子［11］。從不同植物miR858 核心種子區(qū)序列比對來看，丹參Sm-miR858和其他已經鑒定的miR858s完全一致。因為miRNA核心種子區(qū)與靶標基因作用位點核苷酸序列之間的堿基互補配對狀況對miRNA 的剪切或翻譯抑制作用是至關重要的，在這個區(qū)域序列的差異將直接影響miRNA的剪切或翻譯抑制效率。從Sm-miR858 對Sm-PAP1 作用位點來看，其核苷酸序列及其對應的氨基酸保守序列PGRTDNE 也是高度一致的，顯示出了不同植物中miR858 功能的高度保守性。根據本實驗靶標預測結果顯示Sm-miR858 的潛在靶標基因僅有Sm-PAP1，并且在我們的丹參Small RNA 高通量測序結果中也沒有相關的miR828 序列出現(xiàn)，這似乎與其他雙子葉植物中MYB 類轉錄因子被miR858和miR828 雙重調控現(xiàn)象不一致。我們分析出現(xiàn)這種結果的可能原因有兩方面，一方面是研究所提供的丹參cDNA 文庫的基因表達信息量不夠導致Sm-miR858 的預測靶標沒有出現(xiàn)；另一方面可能是丹參Small RNA 高通量測序深度不夠沒有檢測到丹參體內MiR828的序列信息。

總之，論文依次對從丹參Small RNA高通量測序獲得的Sm-miR858 進行序列真實性驗證、靶標預測以及Sm-miR858 與Sm-PAP1 之間表達相關性等進行了較系統(tǒng)的研究。研究結果證實在丹參體內Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標基因。這一實驗結果為在miRNA水平通過基因工程提高丹參體內關鍵轉錄因子的表達奠定了理論基礎。

致謝 感謝陜西師范大學王喆之教授在實驗構思上所給予的指導和幫助。