呂東林 李 騰 郭譯文 姜 靜 黃海嬌*

（1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 遼寧林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110101）

聚合育種是指利用雜交育種、現(xiàn)代分子育種等途徑實現(xiàn)多個外源基因聚合，從而達到育種目標(biāo)的方法。通過多基因聚合等分子育種手段以培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效、穩(wěn)定的農(nóng)作物新品種，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點［1］。迄今為止，已在多種農(nóng)作物上得到應(yīng)用，Hittalmani 等［2］將稻瘟病抗性基因Piz5、Pi1、Pita 成功聚合到BLI24 中，巴 沙 拉 特 等［3］成 功 獲 得Xa4、Xa5、Xa13、Xa21 4 個抗白葉枯病基因的水稻子代純合體；董娜等［4］實現(xiàn)了小麥抗白粉病基因Pm21 和Pm13 的聚合育種；Matsumoto 等［5］對黃瓜（Cucu?mis sativus）進行過基因聚合能夠提高其抗性和抗譜的研究報道，朱明濤等［6］對番茄（Lycopersicones?culentum Mill.）聚合育種的研究得出了一致結(jié)論。

白樺（Betula platyphylla Suk.），落葉喬木，主要分布于我國北方，具有分布廣、耐低溫等特點［7～8］。白樺樹皮灰白色，可成層剝裂，樹干姿態(tài)優(yōu)美，具有獨特的觀賞價值，常被用作行道樹、庭院樹等［9］。研究人員采用基因工程育種手段相繼對白樺進行了遺傳改良，獲得了童期縮短的BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺［10］，提高抗旱耐鹽性的TabZIP 轉(zhuǎn)基因白樺［11］，促進木質(zhì)素含量降低的BpCCR 轉(zhuǎn)基因白樺［12］，維持吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）等動態(tài)平衡的BpGH3.5 轉(zhuǎn)基因白樺［13～14］，抗低溫的BpMYB4轉(zhuǎn)基因白樺［15］，并對能夠影響白樺生長發(fā)育和抗性的BpTCP7 和BpTCP8 基因也進行了研究［16～17］。然而，有關(guān)轉(zhuǎn)基因白樺聚合育種的研究卻鮮見報道，陳素素等［18］以TabZIP、BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺為試材，進行常規(guī)育種，研究表明目的基因通過雌配子的傳遞效率高于雄配子，雌、雄配子外源基因傳遞效率分別在60.00%、30.00%左右，并獲得了TabZIP、BpAP1 基因聚合的PB1、PB5 白樺T1代以及單個BpAP1 基因的P13、P15 和P20 白樺T1代。趙潔等［19］對轉(zhuǎn)入Cry1Ac 和Cry3A 基因的雙Bt轉(zhuǎn)基因巨霸楊（Populus deltocdes 50×P. deltocdes 36）進行過研究報道。本文在陳素素等研究的基礎(chǔ)上，以BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺T1代、BpAP1TabZIP 轉(zhuǎn)基因白樺T1代、BpGH3.5 和BpCCR 轉(zhuǎn)基因白樺為雜交親本，設(shè)計雜交組合，擬進一步驗證轉(zhuǎn)基因白樺目的基因的遺傳規(guī)律，期望獲得3 個基因聚合的T2代個體，是對白樺轉(zhuǎn)基因聚合育種的后續(xù)報道。

1 材料方法

1.1 試驗材料

1.2 種子活力的測定及子代生長性狀分析

1.2.1 種子千粒質(zhì)量的測定

采用百粒法對白樺種子的千粒質(zhì)量進行測定，從各家系中分別隨機取800 粒種子，設(shè)置8 個重復(fù)，每個重復(fù)100 粒，各重復(fù)分別稱重（mg），小數(shù)點后面保留兩位小數(shù)，計算各家系白樺種子的千粒質(zhì)量。

1.2.2 種子活力指標(biāo)的測定

參照陳素素等［18］測定種子活力的方法進行種子發(fā)芽實驗，每個家系重復(fù)3 次，每個重復(fù)100 粒種子，發(fā)芽試驗結(jié)束后分別計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)。隨后，進行播種育苗，并于2017年4月初和9月末分別調(diào)查15個家系的T2代苗高，并運用以下公式計算苗高生長量和苗高相對生長量：

苗高生長量=9月末苗高-4月初苗高

苗高相對生長量=苗高生長量/4月初苗高

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并記錄行CPT1周內(nèi)，CPT前1 h(T1)、CPT開始初期1 h(T2)、CPT結(jié)束后1 h(T3)這3個時間節(jié)點患者的呼吸頻率(RR)、氧合指數(shù)(OI)、血氧分壓(PaO2)及血氧飽和度(SaO2)，同時觀察記錄血流動力學(xué)指標(biāo)：心率(HR)及平均動脈壓(MBP)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2007 進行數(shù)據(jù)處理并對百分?jǐn)?shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)換，利用SPSSv22.0 軟件進行方差分析、多重比較和相關(guān)性分析。

家系遺傳力（H2）公式：

式中：F為方差分析中的F值。

1.3 外源基因的分子檢測

1.3.1 白樺總DNA的提取

采用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，Cat.#DP321-03），分別選取G7、G8、G22、C13 等4 個家系，每個家系隨機采取12～31株幼苗的葉片進行總DNA的提取。

表1 參試白樺家系代碼Table 1 Tested white birch family code

1.3.2 PCR檢測

以白樺總DNA 為模板，對BpGH3.5、BpCCR 轉(zhuǎn)基因雜交親本進行PCR 擴增檢測，設(shè)置中間質(zhì)粒載體pGWB2 為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因白樺（WT）為陰性對照，同時設(shè)置空白水對照。分別根據(jù)Bp?GH3.5、BpCCR 兩端序列設(shè)計引物（見表2）。PCR反 應(yīng) 體 系 如 下：10×Taq buffer 2 μL，dNTP（2.5μmol·L-1）1.6 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1μL，MgCl2（2.5 μmol·L-1）1.2 μL，DNA 1 μL，Taq 酶0.5 μL，最后用H2O 補齊至20 μL。PCR 擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpGH3.5、BpCCR 轉(zhuǎn)基因雜交親本的PCR檢測

以BpGH3.5、BpCCR 轉(zhuǎn)基因白樺DNA 為模板，對待測株系進行PCR 檢測，結(jié)果顯示：4 株親本植株G7、G8、G22、C13均檢測到目的基因（見圖1）。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences for PCR assays

2.2 不同雜交子代種子活力性狀比較

2.2.1 不同雜交子代種子活力性狀差異顯著性分析

通過對各參試家系種子的千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)進行方差分析，結(jié)果顯示：各活力性狀在不同子代家系間的差異均達到了極顯著水平（P<0.01）（見表3）。其中除種子千粒質(zhì)量和平均發(fā)芽時間的變異系數(shù)較小外，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等性狀的變異系數(shù)均在40.00%以上，這表明種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢等性狀在各家系間存在著較大的差異，因此，針對各子代家系進行選優(yōu)意義重大。遺傳力分析結(jié)果顯示：種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等性狀的家系遺傳力均在95.00%以上，表明種子活力性狀主要是由遺傳因素控制的。

2.2.2 不同雜交子代種子活力性狀的多重比較分析

在種子活力性狀在各子代家系間差異達到極顯著水平的基礎(chǔ)上，對28個子代家系的種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢等性狀進行多重比較分析，進一步了解各性狀在家系間的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示：白樺種子千粒質(zhì)量較大的家系，除平均發(fā)芽時間外，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等種子活力指數(shù)也相對較高，家系A(chǔ)G20-6的千粒質(zhì)量高達381.50 mg，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢也分別達到54.02%、7.47%，在28個家系中排名靠前。發(fā)芽率是衡量種子品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)，28個參試家系種子發(fā)芽率的多重比較分析結(jié)果顯示（見表4）：家系A(chǔ)G20-6、CA13、AG20-8和AG20-7的發(fā)芽率排名靠前，均在45%以上，分別為54.02%、46.09%、45.96%和45.94%，其中AG20-6最高。這4個家系的千粒質(zhì)量、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，除AG20-8的發(fā)芽勢較低以外，其他排名也均靠前。

表3 不同雜交子代家系種子活力性狀的方差分析表Table 3 Variance analysis among different hybrid offspring families on seed vigor index

表4 不同雜交子代家系種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間的多重比較Table 4 Multiple comparison thousand-seed weigh，germination rate，germination potential，germination rate and mean time of germination among different families

2.2.3 不同雜交子代家系種子活力性狀相關(guān)性分析

在對各性狀進行多重比較分析的過程中發(fā)現(xiàn)，除平均發(fā)芽時間外，千粒質(zhì)量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽值等性狀在排序過程中表現(xiàn)出相對的一致性，因此針對各性狀進行相關(guān)性分析（見表5），結(jié)果顯示：千粒質(zhì)量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)間 的 相 關(guān) 系 數(shù) 分 別 為0.611、0.603、0.528（P＜0.01），其他性狀間的相關(guān)系數(shù)均大于0.800，說明參試家系的種子活力指標(biāo)之間具有極其顯著的相關(guān)性。

2.3 外源基因在雜交子代中的傳遞規(guī)律

選取4 個雜交子代家系，進行葉片總DNA 的提取，采用PCR 擴增技術(shù)檢測不同株系中目的基因（BpGH3.5、BpAP1、TabZIP、BpCCR）在雜交T2代中的分離情況，然后統(tǒng)計各基因型的株數(shù)及比例，利用卡方檢測法對基因型的比例進行驗證，分析外源目的基因插入位點數(shù)及在T2代中的傳遞規(guī)律。

由表6可見，目的基因能夠通過一定的方式遺傳給子代且不同轉(zhuǎn)基因株系的子代外源基因檢出率不同。通過對AG20-1、AGB5-1、AG20-4、ACB2-1這4 個家系進行PCR 檢測，由于每個家系僅檢測了12～31株幼苗，其中AG20-1、AGB5-1、AG20-4分別為24、31 和26 株，ACB2-1 更是顯著小于30 株，PCR 檢測結(jié)果的性狀分離比例與理論性狀分離比例可能會存在較大的偏差甚至不具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此對4 個家系的檢測結(jié)果進行適應(yīng)性檢驗。根據(jù)AG20-1、AGB5-1、AG20-4、ACB2-1 群體中目的基因組合及分離的4種基因型株數(shù)，推測其比例為1∶1∶1∶1，通過卡方檢驗，其值分別為12.33、9.52、19.54、4.67，前三者均顯著大于X20.05（3）（7.82），后者小于X20.05（3）（7.82）。其中由于ACB2-1 的檢測樣本數(shù)僅為12株，其檢驗誤差較大，因此不能得出其目的基因能夠按照孟德爾遺傳規(guī)律進行傳遞的結(jié)論。對AGB5-1 和ACB2-1 家系子代進行PCR 的結(jié)果顯示，AGB5-1 子代群體中檢測出BpAP1、Bp?GH3.5，ACB2-1 子 代 群 體 中 檢 測 出TabZIP、BpAP1，即未獲得3個目的基因聚合的子代個體。

表5 不同雜交子代家系種子活力性狀的相關(guān)分析Table 5 Correlation analysis among seed vigor charac‐ter of different families

2.4 雜交子代生長性狀分析

對參試家系的苗高、苗高生長量、苗高相對生長量進行方差分析（見表7）研究表明：各性狀在不同雜交子代家系間均達到極顯著差異（P<0.01）。各性狀的變異系數(shù)均在36.77%～60.00%，表明不同雜交子代苗高、苗高生長量、苗高相對生長量的整齊性一般。各性狀的家系遺傳力均在在0.85 以上，其中苗高和苗高生長量家系遺傳力均為0.91，說明苗高、苗高生長量、苗高相對生長量主要是受遺傳因素控制。

各性狀在家系間差異達到極顯著水平的基礎(chǔ)上，對參試家系的苗高、苗高生長量等性狀進行多重比較分析（見表8），進一步了解各性狀在家系間的關(guān)系。結(jié)果表明：對苗高、苗高生長量、苗高相對生長量進行由大到小的排序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：G22、GA8 和GA22 的苗高最高，分別為52.30、51.03 和49.55 cm；這3 個家系的苗高生長量的排名也靠前，分別為48.08、44.46 和45.18 cm；相對生長量除GA8 低一些，其他兩個家系的相對生長量仍然很高，為12.58 和11.93 cm。這說明家系間的苗高和苗高生長量表現(xiàn)出一致性，即苗高排名靠前的家系，其苗高生長量排名也靠前。苗高相對生長量與苗高和苗高生長量的一致性相對較差。

表6 外源基因在子代中的PCR鑒定及χ2檢測Table 6 Detection of the foreign genes in offspring and Chi-square testing

表7 不同雜交子代苗高、苗高生長量、苗高相對生長量的方差分析Table 7 Variance analysis on seedling height，seedling growth，relative growth of seedlings among different families

表8 不同雜交子代苗高、苗高生長量、苗高相對生長量多重比較Table 8 Multiple comparison seedling height，seedling growth，relative growth of seedlings among different families

3 討論

林木轉(zhuǎn)基因的目的是按照人們預(yù)期的育種目標(biāo)培育良種［20］。單個基因的優(yōu)良特性往往不能滿足生產(chǎn)生活的需要。例如：抗病育種中，由于病菌的變異等因素，利用單基因的抗性進行防治就存在較大的風(fēng)險，所以利用不同抗性基因的協(xié)同作用并實現(xiàn)聚合育種是當(dāng)今學(xué)者研究的熱點［21］。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因工程等方法已在多種動植物上實現(xiàn)多基因的聚合育種。基因工程等分子育種手段能夠快速獲得多基因聚合的個體，而林木轉(zhuǎn)基因體系較難建立且林木生長周期長，所以以縮短童期的BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺為載體，采用常規(guī)育種方法研究林木轉(zhuǎn)基因植株間的聚合育種是一個有效的途徑。

本研究進行轉(zhuǎn)基因植株間的雜交，測定了雜交子代千粒質(zhì)量、發(fā)芽率等活力指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子活力指標(biāo)間均呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與陳素素［18］、王朔［22］等研究結(jié)果一致，千粒質(zhì)量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)呈極其顯著的正相關(guān)關(guān)系，認(rèn)為千粒質(zhì)量是種子活力的基礎(chǔ)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)目的基因的隨機插入降低了白樺雜交子代種子活力，其AG20-1、AGB5-1、AG20-4、ACB2-1 的發(fā)芽率分別為38.96%、31.98%、40.23%和11.35%。目的基因的隨機插入對雜交子代活力的影響與正反交有著密切的聯(lián)系，除CA13 外，GA18、GA22 的發(fā)芽率僅為26.94%、28.84%，表明雌配子的穩(wěn)定遺傳能力較雄配子強，且目的基因BpCCR 對白樺種子活力的影響較目的基因BpGH3.5 小。采用PCR 擴增法對雜交T2代的外源基因進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入母本基因組中BpAP1 基因的檢出率分別為20.83%和46.15%，而插入父本基因組中Bp?GH3.5 基因的檢出率分別為50.00%和61.54%，顯然雜交T2代群體中插入父本基因組的目的基因檢出率較高，其雌雄配子的傳遞效率分別為30.00%和50.00%左右。陳素素等［18］有關(guān)轉(zhuǎn)基因白樺T1代的研究表明，雌配子的傳遞效率要高于雄配子，周靜等［24］認(rèn)為由于外源基因的插入，植物花粉的發(fā)芽力、受精能力等均受到了不利影響，因而雌配子的傳遞效率較雄配子高。本研究與前人的研究結(jié)果偏差較大，認(rèn)為目的基因通過轉(zhuǎn)基因植株間雜交而進行傳遞，在T2雜交子代中，其種子活力進一步降低，同時由于1年生BpAP1轉(zhuǎn)基因白樺T1代和多年生BpGH3.5、BpCCR轉(zhuǎn)基因白樺的插入位點不能確定，導(dǎo)致其雜交T2代群體中插入位點不能確定，目的基因在T2代的遺傳規(guī)律是否符合孟德爾遺傳規(guī)律有待進一步研究證明。有研究表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因植株子代的傳遞規(guī)律呈多樣性，通常轉(zhuǎn)基因植株中有10%～50%的頻率不符合孟德爾遺傳規(guī)律［23～26］，因此有關(guān)轉(zhuǎn)基因白樺目的基因在子代群體中傳遞規(guī)律需要進一步進行驗證。

外源基因的整合對發(fā)芽率等性狀的影響效果不 顯 著［18］，結(jié) 合PCR 檢 測 結(jié) 果，認(rèn) 為 以1 年 生BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺T1代為母本，多年生轉(zhuǎn)基因白樺為父本的雜交過程中，T2代種子的發(fā)芽率大幅度降低，初步說明外源基因的再次傳遞降低種子活力。本研究未獲得3目的基因聚合的T2代個體，在對T2代群體長期監(jiān)測的基礎(chǔ)上同時結(jié)合PCR 檢測結(jié)果，許多實現(xiàn)基因聚合的子代個體往往是生長狀況較差的個體，且許多幼苗個體在成苗后的一定時期便發(fā)生枯死現(xiàn)象，研究認(rèn)為是有目的基因的聚合，多基因的疊加效應(yīng)對白樺轉(zhuǎn)基因雜交子代個體的生長發(fā)育產(chǎn)生了不利的影響，并可能導(dǎo)致致死現(xiàn)象，因此未能獲得3目的基因聚合的T2代個體。

常規(guī)育種方法具有簡單、易操作的特點。研究表明利用常規(guī)育種方法開展轉(zhuǎn)基因白樺間的聚合育種研究是具有可行性的。轉(zhuǎn)基因白樺間雜交后，目的基因在其雜交子代的傳遞規(guī)律，多個目的基因聚合后對白樺子代個體生長產(chǎn)生的影響以及表達調(diào)控機制等都是我們關(guān)注的重點，后續(xù)將利用縮短童期的BpAP1 轉(zhuǎn)基因白樺作為優(yōu)良載體，采用常規(guī)育種方法并結(jié)合分子標(biāo)記、二代測序等分子技術(shù)，進一步探討轉(zhuǎn)基因白樺間雜交后，目的基因在子代群體的遺傳規(guī)律。