王仁睿 湯玲莉 蘇仕林 劉成才 李 杰

（西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）為蘭科（Orchi?daceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）多年生草本植物，花形奇特、花色艷麗、花期長久，具有極高的觀賞價值，在觀賞花卉中占有極為重要的地位，被譽為“蘭中皇后”，深受消費者青睞，繼而形成了蝴蝶蘭產業(yè)［1～2］。我國蝴蝶蘭產業(yè)從20 世紀80 年代初開始興起，經(jīng)過近幾年的發(fā)展，我國由以前的蝴蝶蘭輸入國逐漸轉變?yōu)樯a輸出大國，從最北新疆、內蒙古到最南端的海南島都有蝴蝶蘭生產基地［3］。但我國蝴蝶蘭品質和蝴蝶蘭生產強國相比仍有較大的差距，造成該現(xiàn)象最主要的原因是蝴蝶蘭種苗普遍感染病毒，品質不佳［4～5］。

目前已報道感染蝴蝶蘭病毒有25 種，其中建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是侵染蝴蝶蘭最主要病毒之一，國際上已認識到這種病毒的危害，多數(shù)國家現(xiàn)已推行了種苗植物檢疫證書制度，對進口蝴蝶蘭嚴格規(guī)定不能攜帶此類病毒［6］。植物感染CymMV 后，葉片和花瓣出現(xiàn)褪綠條紋或壞死斑點，抑制植物生長［7］。植株一旦感染病毒無法根治，長期的無性繁殖導致病毒不斷積累，蝴蝶蘭感染CymMV 病毒的情況十分普遍。栽培無毒苗是目前生產上防治病毒的有效方法，生產無毒苗是實現(xiàn)無毒化栽培的核心技術［8］。

目前國內外對CymMV 病毒的脫除主要有莖尖培養(yǎng)［9～10］、化學藥劑法［11～12］、化學藥劑結合莖尖培養(yǎng)法［4，13］和熱處理結合莖尖培養(yǎng)法［4，14］，其中以化學藥劑結合莖尖培養(yǎng)最常用。此外，還有納米技術應用于CymMV 的脫除研究，用以降低病毒濃度，并增強植物對CymMV 的抗性［15］。以上幾種主要的脫毒方法存在三方面的問題：①分生組織過小易褐化，據(jù)研究表明，蝴蝶蘭的莖尖小于1 mm以下時褐化率和死亡率均為100%［10，14］；②化學藥劑對植物具有毒害作用［10，16］；③化學藥劑易引起種苗變異［17］。由此可見，對蝴蝶蘭建立高效、安全的新型脫毒技術對于實際生產和科研研究均具有重要的意義。

超低溫脫毒是在超低溫保存技術上延伸出來、目前發(fā)展迅猛的一種新型脫毒技術［18～19］，指將感染病原體（病毒、植原體、細菌）的材料經(jīng)液氮短暫處理后脫除病原體。迄今為止，超低溫脫毒技術已在15 種植物上有所應用，成功脫除了25 種病毒、2 種植原體、1 種類病毒和1 種細菌［20］。與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫脫毒技術具有不需要剝取過小的莖尖［18～19］、對植物不產生毒害、再生植株遺傳穩(wěn)定［21］等優(yōu)勢。超低溫脫毒技術尚未應用于蝴蝶蘭脫毒，建立該技術體系有望解決蝴蝶蘭脫毒存在的以上問題。

本研究擬以感染CymMV 的蝴蝶蘭品種“滿天紅”為試驗材料，分別從蔗糖預培養(yǎng)濃度、預培養(yǎng)時間和PVS2 處理時間三個關鍵因素進行篩選，PVS2 是指不含生長激素的MS（Murashige and Skoog medium）液體培養(yǎng)基+30%甘油（w/v）+15%乙二醇+15%DMSO（dimethyl sulfoxide）+0.4 mol·L-1蔗糖，pH為5.8［22］，超低溫莖尖誘導類原球莖，再誘導成苗，再生植株經(jīng)過RT-PCR 方法進行病毒檢測，驗證CymMV 的脫毒情況，脫毒苗進行增殖和生根，建立蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系，為蘭科植物脫除CymMV 的后續(xù)研究提供了技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料選用本實驗室收集的蝴蝶蘭品種“滿天紅”，建立組培體系。蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基為BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1，pH值為6.0。BM成分為花寶1號（Hy?ponex No.1，氮、磷、鉀含量分7∶6∶9）3 g·L-1+Fe.Na.EDTA 10 ml·L-1+有機物（肌醇20 000 mg·L-1+煙酸100 mg·L-1+鹽酸吡哆醇100 mg·L-1+鹽酸硫胺素20 mg·L-1+甘氨酸400 mg·L-1，配成100 倍母液）10 ml·L-1+蛋白胨1.5 g·L-1。培養(yǎng)溫度為26±2℃，光照強度45μmol·m-2·s-1，光照周期14 h·d-1。

1.2 病毒檢測

將超低溫脫毒前、超低溫脫毒后的再生植株（6 個月）各取8 株，3 次重復，經(jīng)過RT-PCR 分子檢測，確定病毒情況。稱取0.1 g植物葉片，在研缽中添加液氮進行研磨，采用RNA試劑盒（天根生化科技有限公司）按照試劑盒說明書提取植物總RNA，采用紫外吸收法檢測RNA 質量。以合格的RNA為模板，用Takara 反轉錄試劑盒反轉錄合成cD?NA，進行質量檢查后將符合條件的cDNA 作為模板，離心管 中依次添加10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL、cDNA 模 版1 μL、rTaq DNA 聚合酶0.2 μL，病毒正反引物（CymMVF： GTCGACCGCTTACTACGCAAAAGTGGTGTG、CymMV-R： CTGCAGCGACGGCATCGAAGAAGT?CAAAG）［23］各1.0μL，ddH2O 水補足至20μL，瞬時離心混勻。反應體系為：48℃保溫45 min，94℃變性30 s，從60℃開始，每個循環(huán)遞減0.5℃，退火30 s，72℃延伸2 min，進行10 個循環(huán)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，21 個循環(huán)，72℃再延伸7 min。

1.3 蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系的關鍵因素篩選

1.3.1 不同濃度的蔗糖預培養(yǎng)

以確定感染CymMV 病毒的組培苗（6周苗齡）為對象，在體視顯微鏡下用無菌手術刀切取5～6 mm 大小的莖尖（見圖1a），在BM+0.3、0.6、0.8、1.0 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1 d。室溫條件下用加載液（BM+2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖）處理莖尖20 min。在0℃條件下用PVS2 玻璃化溶液浸泡莖尖60 min，用移液槍吸取0℃的PVS2 溶液，在鋁箔條（2×0.8 cm）上形成一個個小滴（大小約為2.5 μL）（見圖1b），將莖尖逐個放入小滴中，用鑷子夾住鋁箔條，投入液氮，再將冷凍管投入液氮，待液氮充滿冷凍管后，將鋁箔條轉至冷凍管，液氮保存1 h。夾起鋁箔條，放入卸載液（BM+1.2 mol·L-1蔗糖）室溫卸載20 min。處理完的莖尖放置在無菌的濾紙上吸干卸載液，轉入再生培養(yǎng)基BM+GA32.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1，暗培養(yǎng)3 d，轉入類原球莖培養(yǎng)基BM+BA 5.0 mg·L-1+NAA 0.7 mg·L-1+活性炭2 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1［24］進行誘導，正常光照培養(yǎng)。

在海南建省辦經(jīng)濟特區(qū)之前，剛碩士畢業(yè)的程立生便登上海南島，任華南熱帶農業(yè)大學教師、系主任助理、教務處副處長、處長、研究生處處長。程立生還擔任過3年樂東縣科技副縣長。

1.3.2 不同天數(shù)的蔗糖預培養(yǎng)

剝取的莖尖在BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1、2、3、4 d。再經(jīng)過加載、PVS2 處理、形成小滴、冷凍、卸載、再生培養(yǎng)，步驟同上。

1.3.3 PVS2處理時間

剝取的莖尖在BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1 d。經(jīng)過加載后，在0℃條件下用PVS2玻璃化溶液浸泡莖尖30、60、90、120、150 min，再形成小滴、冷凍、卸載、再生培養(yǎng)，步驟同上。

1.4 類原球莖的成苗

將誘導的類原球莖切成小塊（>3 mm），轉移到BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基［24］進行生長，1 個月后類原球莖即可變綠成苗。

1.5 再生植株的增殖和生根

將再生植株逐一分成單棵，培養(yǎng)6個月后隨機選取8 株，重復3 次，經(jīng)病毒檢測，將RT-PCR 陰性結果的植株轉移到BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基上進行增殖，6 周后，將增殖的植株轉到1/2BM+BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基［14］誘導生根。

1.6 實驗設計與數(shù)據(jù)分析

采用單因素實驗篩選蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系各關鍵因素，每個處理選用10 個莖尖，3 次重復。超低溫莖尖（+LN）指經(jīng)過預培養(yǎng)、加載、PVS2 處理、形成小滴、液氮冷凍、卸載和再生培養(yǎng)階段的莖尖，對照莖尖（-LN）指經(jīng)過其他幾個階段但不經(jīng)液氮冷凍的莖尖。超低溫處理7 d 后統(tǒng)計成活率，底部褐色，分生組織綠色的蝴蝶蘭莖尖（見圖1c）記為成活莖尖，整體褐色的蝴蝶蘭莖尖（見圖1d）記為死亡莖尖，長出葉片的莖尖視為再生。

8周統(tǒng)計再生率：

再生率（%）=（再生莖尖數(shù)/總莖尖數(shù)）×100%（2）

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 版進行單因素方差分析和t檢驗，數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)中不同字母代表最小顯著性P<0.05，采用Sigmaplot 14.0版進行制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的蔗糖預培養(yǎng)

成活的超低溫莖尖在21 d 可觀察到明顯的再生（見圖1e），兩個月形成類原球莖（見圖1f）。不同濃度的蔗糖預培養(yǎng)對超低溫莖尖的成活率和再生率具有顯著影響（見表1）。隨著蔗糖濃度的增加，超低溫莖尖的成活率和再生率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。經(jīng)BM+0.6 mol·L-1蔗糖處理1 d 后經(jīng)過超低溫脫毒處理，超低溫莖尖的成活率為76.7%，與0.8～1.0 mol·L-1蔗糖的成活率差異不顯著，再生率為56.7%，顯著高于其他處理。對照莖尖在0.3～0.6 mol·L-1蔗糖范圍內的成活率和再生率均高于0.8～1.0 mol·L-1蔗糖的兩個處理。

2.2 不同培養(yǎng)時間的蔗糖預培養(yǎng)

隨著蔗糖預培養(yǎng)時間的延長，對照莖尖和超低溫處理莖尖的成活率和再生率均出現(xiàn)了下降的趨勢（見表2）。蔗糖預處理1～3 d，對照莖尖和超低溫莖尖的成活率、對照莖尖的再生率并未顯著差異，但蔗糖預培養(yǎng)1～2 d，超低溫處理莖尖的再生率分別為56.7%和53.3%，顯著高于3～4 d 處理。當蔗糖預培養(yǎng)為4 d 時，超低溫處理的莖尖降至6.7%。

表1 蔗糖濃度對莖尖（對照、超低溫）成活率和再生率的影響Table 1 Effect of sucrose concentration in preculture medium on survival rate and regrowth rate of shoot tips(-LN and+LN)

表2 蔗糖預培養(yǎng)天數(shù)對莖尖（對照、超低溫）成活率和再生率的影響Table 2 Effect of sucrose duration in preculture medi‐um on survival rate and regrowth rate of shoot tips（-LN and+LN）

2.3 PVS2處理時間

對照莖尖的成活率和再生率隨著PVS2 處理時間的延長呈逐漸下降趨勢（見圖2）。對于超低溫莖尖而言，PVS2 處理時間對成活率和再生率影響顯著，隨著PVS2 處理時間的延長，成活率和再生率均出現(xiàn)先升高再下降的趨勢。PVS2 處理60-90 min，超低溫莖尖的成活率和再生率分別為66.7%～63.3% 和46.7%～43.3%，顯 著 高 于 其 他時間。

篩選出最佳蔗糖預培養(yǎng)濃度、時間和PVS2 處理時間三個關鍵因素，將類原球莖分割繼續(xù)培養(yǎng)成苗后，通過RT-PCR 進行CymMV 的檢測，陰性結果的植株進行增殖（見圖1g）和生根（見圖1h）。

2.4 蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系對CymMV的脫除情況

將超低溫脫毒前、超低溫脫毒后的再生植株先后進行RT-PCR 病毒檢測，結果顯示，超低溫脫毒前植株全部攜帶CymMV（見圖3a），超低溫脫毒處理后的再生植株有一半未檢測到CymMV（見圖3b），脫毒率為50%。

3 討論

本研究建立了蝴蝶蘭品種‘滿天紅’莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系，最佳的蔗糖預培養(yǎng)是BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1～2 d；最優(yōu)的PVS2 處理時間是60～90 min。超低溫脫毒處理后的再生植株經(jīng)RT-PCR 檢測，CymMV 的脫毒率為50%。

在莖尖培養(yǎng)脫毒研究中，莖尖大小與成活率成正比，但與脫毒率成反比。Lim，et al.［12］報道采用病毒唑結合莖尖培養(yǎng)，0.1 mm 的莖尖不能成活和再生，1 mm 的莖尖可以成活但不能脫除Cym?MV。目前在CymMV 的脫毒研究中，主要采用藥劑處理結合莖尖培養(yǎng)或熱處理結合莖尖培養(yǎng)，所取的莖尖大小為1～2 mm，剝取難度大，褐化的風險增大［10，13～14］；其次，脫除效率因檢測手段不同而差異很大，賀嘉［4］報道藥劑結合莖尖培養(yǎng)采用含6 g·L-1板藍根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后剝取莖尖培養(yǎng)、38/32℃處理35 d后剝取莖尖培養(yǎng)和莖尖在50 mg·L-1病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周三種方法進行脫毒，再生植株經(jīng)RT-PCR 檢測，脫毒率分別為77.3%、46.7%和33.3%；許傳俊等［25］將幼苗轉至含40 mg·L-1病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 個月，再剝取莖尖進行培養(yǎng)，再生植株經(jīng)ELISA 檢測，脫毒率為30%；李正民［26］報道腋芽在含1.0 mg·L-1氨基寡糖素或30 mg·L-1病毒唑的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d，試紙條檢測再生植株，氨基寡糖素和病毒唑的的脫毒率均為83.3%；劉福秀等［27］報道花梗組織培養(yǎng)結合5～15 mg·L-1病毒A，再生植株經(jīng)DAS-ELISA 和RTPCR 檢測，脫毒率分別為89.6%～100%和63.5%～74%?？梢钥闯?，DAS-ELISA 的靈敏度不夠，部分研究僅采用ELISA 對脫毒苗進行檢測，假陰性結果多，脫毒率比RT-PCR 檢測的結果要高，因此在脫毒研究中應采用RT-PCR 方法進行檢測，保證結果的可靠性。本研究中CymMV 的脫毒率為50%，與部分研究結果接近，證明超低溫療法對于脫除CymMV 是有效的，而且本研究中所取的莖尖大小為5～6 mm，大大降低莖尖剝取的難度，有效避免了褐化造成不易成活的問題。

超低溫脫毒目前已經(jīng)應用于李［28］、香蕉［29～30］、葡萄［31～32］、馬鈴薯［33～35］等多種植物，成功脫除多種病毒、類病毒、植原體和細菌。研究者們報道了品種的差異對脫毒率有很大影響，如感染了蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）的6 個品種經(jīng)超低溫處理后，脫毒率最低為60%，最高為100%［36］；馬鈴薯10 個品種經(jīng)超低溫處理后，馬鈴薯S 病毒（Potato Virus S，PVS）的脫毒率為60%～100%［37］。植物莖尖細胞經(jīng)液氮處理后，絕大部分細胞被凍死，僅有分生組織頂端幾層細胞和第一、二葉原基的部分細胞能成活，病毒侵染莖尖能力不同，對于不能侵染到莖尖頂端分生組織和第一、二葉原基的病毒，超低溫脫毒的脫除效率很高［38］。感染菊花B 病毒（Chrysanthemum Virus B，CVB）的莖尖經(jīng)超低溫處理后，經(jīng)石蠟切片觀察，頂端分生組織和第1～3 片葉原基細胞成活，其余區(qū)域死亡，60%的莖尖大部分區(qū)域均有CVB 的分布，包括頂端分生組織和第1～2 片葉原基，40%的莖尖頂端分生組織和第1～2 片葉原基沒有檢測到病毒的存在，CVB的脫毒率為30.8%［39］。目前超低溫脫毒應用于脫除CymMV 的研究尚未見報道，本研究僅對蝴蝶蘭一個品種開展了超低溫脫毒研究，不同品種之間是否存在脫毒差異的現(xiàn)象、超低溫脫毒對CymMV 的脫除機理等還有待進一步研究。