耿鈺涵 程 超 吳悅豪 方維明 楊正飛 尹永祺

(揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127)

褪黑素是一種胺類激素，具有改善睡眠、延緩衰老、抗擊腫瘤及提高免疫力等多種生理功效[1-3]。目前，市面上以褪黑素為主要功能成分的保健品和膳食補充劑大多為化學(xué)合成的[4]。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素廣泛存在于植物組織中，且其含量與植物種類、生長階段、組織器官及外界環(huán)境密切相關(guān)[5]。褪黑素生物合成活性在植物的幼嫩組織中較高，且植物在不同的環(huán)境條件下，尤其是在逆境條件下其體內(nèi)褪黑素含量顯著增加。Byeon 等[6]發(fā)現(xiàn)，將水稻幼苗置于55℃的黑條件下1 h，其褪黑素含量由2.95 ng·g-1提高到4.90 ng·g-1。綠藻經(jīng)高溫和重金屬處理褪黑素含量有所升高，且外源性褪黑素的添加緩解了鎘脅迫對藻類的影響[7]。向日葵在鹽脅迫條件下，褪黑素含量上升[8]。因此，通過調(diào)控植物生長發(fā)育以促進其體內(nèi)褪黑素積累，進而開發(fā)富含褪黑素的營養(yǎng)食品以補充人體所需的褪黑素是一種環(huán)保、綠色的保健方式，符合未來的發(fā)展方向。

芥菜(Brassica junceaL.)是十字花科蕓薹屬一年生或二年生草本植物，分布廣泛，是我國重要的鮮食和加工蔬菜[9]。研究發(fā)現(xiàn)，相較于其他植物源食品原料，芥菜中褪黑素含量最高[10]。本研究通過前期試驗發(fā)現(xiàn)，芥菜芽苗經(jīng)紫外和熱激處理可顯著提高其褪黑素含量，但其作用機制尚不明確。此外，芥菜中硫代葡萄糖苷被催化水解得到的異硫氰酸酯具有抗氧化、殺菌、抗癌等多種生理功效[10-11]。在高等植物中，色氨酸經(jīng)色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)、色氨酸5-羥化酶(tryptophan 5-hydroxylase，T5H)、血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin N-acetyltransferase，SNAT)、乙?；逅丶谆D(zhuǎn)移酶(acetyl serotonin methyl transferase，ASMT)催化形成褪黑素[12]。研究紫外處理和熱激處理下這些褪黑素關(guān)鍵合成酶的基因表達變化有助于分析褪黑素富集的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥菜種子(長合甜脆大肉芥菜)，廣州長合種子有限公司，-20℃儲存。乙腈(色譜純)，美國Sigma 公司；總抗氧化能力檢測試劑盒(A015-1)、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(A005-1)，南京建成生物工程研究所；植物RNA 提取試劑盒(R6827)，美國OMEGA公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、TB Green Premix Dimer Eraser(RR091A)，日本TaKaRa 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pGX-150 型智能光照培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；DICO 型臺式離心機，上海Thermo Fisher 有限公司；UV-7504C 型紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；Agilent 1200 液相色譜儀、熒光檢測器系統(tǒng)，美國Agilent 科技有限公司；Stepone plus 熒光定量PCR，美國ABI 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 取芥菜種子10 g，按料液比1 ∶10(g·mL-1)置于1 %(v/v)次氯酸鈉水溶液中浸泡消毒15 min，之后用蒸餾水沖洗pH 值至中性，然后置于30℃蒸餾水中浸泡4 h。浸泡后的芥菜種子置于鋪有蛭石的小盒中，噴施60 mL 蒸餾水，分別設(shè)置以下處理組:

(1)對照(CK):置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，每天16 h 光照/8 h 黑暗，每天噴施20 mL 去離子水。

(2)紫外(ultraviolet，UV)處理:置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，每天16 h 光照/4 h 黑暗/4 h UV 照射，每天噴施20 mL 去離子水。

(3)熱激(Heat)處理:置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，每天16 h 光照/7.5 h 黑暗，并于每天13:30 放入50℃避光恒溫箱30 min，每天噴施20 mL 去離子水。

芽苗共發(fā)芽7 d，于發(fā)芽4 d 和7 d 取樣，液氮速凍后置于-20℃保存，測定相關(guān)指標(biāo)。

陳少平：2019年，廣東墾區(qū)上下將全面貫徹黨的十九大和十九屆二中、三中全會精神，以習(xí)近平新時代中國特色社會主義思想為指導(dǎo)，深入貫徹習(xí)近平總書記對農(nóng)墾和廣東重要講話精神，高舉新時代改革開放旗幟，抓住粵港澳大灣區(qū)建設(shè)這一大機遇、大文章，立足農(nóng)墾定位，發(fā)揮墾區(qū)優(yōu)勢，持續(xù)推進“走出去”發(fā)展，讓廣東農(nóng)墾的發(fā)展搭上新一輪改革發(fā)展的快車，為實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略、質(zhì)量興農(nóng)戰(zhàn)略、健康中國戰(zhàn)略做出廣墾貢獻。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 形態(tài)特征 各處理組隨機選取芥菜芽苗，用相機拍攝其形態(tài)特征。

1.3.2.2 芽長 各處理組隨機選取30 株芽苗，用游標(biāo)卡尺測量其根尖到頂端的長度，取平均值。

1.3.2.3 過氧化氫含量 采用分光光度法測定[13]。

1.3.2.4 可溶性蛋白含量 采用考馬斯亮藍G250法測定[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2.5 總抗氧化能力 采用總抗氧化能力檢測試劑盒測定。

1.3.2.6 谷胱甘肽過氧化物酶活性 采用谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒測定。

1.3.2.7 異硫氰酸酯含量 參照J(rèn)iao 等[15]的方法測定。

1.3.2.8 褪黑素含量 參照Arnao 等[16]的方法，稍作修改。取0.2 g 芥菜芽苗組織切片(3～5 mm)，不進行均質(zhì)化處理，置于裝有3 mL 氯仿∶甲醇(30 ∶1，v ∶v)的棕色小瓶中，于4℃恒溫箱中振蕩15 h。然后于12 000×g離心10 min，將下層清液避光真空干燥，再用100 μL 35%甲醇溶解，取20 μL 樣本采用高效液相色譜法測定褪黑素含量。色譜柱:ZORBAX SB-C18 柱(5 μm 粒徑，4.6 mm×250 mm)；梯度洗脫(42%～50%甲醇梯度洗脫27 min，50%甲醇等體積洗脫)；流速:0.3 mL·min-1； 分離時間:31 min；檢測器溫度:30℃。在280 nm 激發(fā)光和348 nm 發(fā)射光下測定褪黑素含量。

1.3.2.9 關(guān)鍵酶基因表達量 參照吳艷迪[17]的方法，獲得褪黑素合成酶關(guān)鍵基因TDC、T5H、SNAT、ASMT的基因序列。根據(jù)NCBI 上報道的其他植物褪黑素合成酶的同源蛋白，并與芥菜基因組數(shù)據(jù)庫(http:/ /brassicadb. org/brad/index. php) 比 較，作 為DNAMAN 軟件的參考。選擇具有保守功能域且與其他相應(yīng)植物基因同源性超過30%的潛在同源基因作為候選基因。表1 為熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)的引物序列。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0 軟件分析，采用Tukey 多重比較，在0.05 水平上進行顯著檢驗，基因表達數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[18]處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜芽苗形態(tài)特征、芽長和過氧化氫含量

由圖1-A 可知，相較于CK，經(jīng)紫外處理和熱激處理的芥菜芽苗生長受到抑制，其葉片變小且芽長、根長均受到影響，而紫外和熱激兩處理間形態(tài)差異較小。由圖1-B 可知，隨著發(fā)芽時間的延長，紫外處理和熱激處理的芥菜芽苗芽長呈增長趨勢，兩種處理的芽苗芽長均顯著低于CK(P＜0.05)，但紫外處理和熱激處理的芽苗芽長無顯著差異(P＞0.05)。由圖1-C 可知，過氧化氫含量隨發(fā)芽時間延長呈下降趨勢。發(fā)芽7 d時，熱激處理的芥菜芽苗過氧化氫含量較CK 顯著下降(P＜0.05)，且紫外處理和熱激處理后芽苗的過氧化氫含量均低于CK。表明紫外處理和熱激處理抑制了芥菜芽苗的生長。

表1 qRT-PCR 的引物序列Table 1 Primers sequences used for qRT-PCR

2.2 可溶性蛋白含量

由圖2 可知，發(fā)芽期間，紫外處理與熱激處理的芥菜芽苗中可溶性蛋白含量顯著高于CK(P＜0.05)，發(fā)芽4 d 時，熱激處理的芽苗中可溶性蛋白含量較紫外處理也顯著提高(P＜0.05)，此時，紫外處理與熱激處理芥菜芽苗的可溶性蛋白含量分別是CK 的1.44 和1.95 倍，熱激處理芥菜芽苗的可溶性蛋白含量是紫外處理的1.36 倍。說明紫外處理與熱激處理可顯著提高芥菜芽苗中可溶性蛋白的含量。

圖1 紫外處理和熱激處理對芥菜芽苗形態(tài)特征、芽長和過氧化氫含量的影響Fig.1 Effect of UV and heat stress treatments on morphological characterization，sprout length andhydrogen peroxide content of mustard sprouts

圖2 紫外和熱激處理對芥菜芽苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of UV and heat stress treatments on soluble protein content of mustard sprouts

2.3 總抗氧化能力

由圖3 可知，發(fā)芽期間，紫外處理和熱激處理的芥菜芽苗總抗氧化能力均顯著高于CK(P＜0.05)。發(fā)芽4 d 時，熱激處理芥菜芽苗的總抗氧化能力與紫外處理差異不顯著(P＞0.05)。發(fā)芽7 d 時，熱激處理芥菜芽苗的總抗氧化能力顯著高于紫外處理(P＜0.05)。表明芥菜芽苗經(jīng)紫外處理和熱激處理后總抗氧化能力顯著提高。

圖3 紫外和熱激處理對芥菜芽苗總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of UV and heat stress on total antioxidant capacity of mustard sprouts

2.4 谷胱甘肽過氧化物酶活性

由圖4 可知，發(fā)芽4 d 時，熱激處理芥菜芽苗的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于紫外處理(P＜0.05)，紫外處理芥菜芽苗的谷胱甘肽過氧化物酶活性與CK間差異不顯著(P＞0.05)。發(fā)芽7 d 時，紫外處理和熱激處理芥菜芽苗的谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著高于CK(P＜0.05)。表明芥菜芽苗經(jīng)紫外和熱激脅迫作用后，谷胱甘肽過氧化物酶活性提高。

圖4 紫外和熱激處理對芥菜芽苗谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect of UV and heat stress treatment on glutathione peroxidase activity of mustard sprouts

2.5 異硫氰酸酯含量

由圖5 可知，隨發(fā)芽時間的延長，各處理芥菜芽苗的異硫氰酸酯含量均下降。發(fā)芽4 d 時，各處理芥菜芽苗的異硫氰酸酯含量無顯著差異(P＞0.05)。發(fā)芽7 d 時，熱激處理芥菜芽苗的異硫氰酸酯含量較CK 顯著提高(P＜0.05)，是CK 的1.78 倍。說明熱激處理可提高芥菜芽苗中異硫氰酸酯的含量。

圖5 紫外和熱激處理對芥菜芽苗異硫氰酸酯含量的影響Fig.5 Effect of UV and heat stress treatments on isothiocyanate content of mustard sprouts

2.6 褪黑素含量

由圖6 可知，發(fā)芽4 d 時，紫外處理芥菜芽苗的褪黑素含量與CK 無顯著差異(P＞0.05)，紫外處理與熱激處理芥菜芽苗的褪黑素含量分別是CK 的1.17 和2.89 倍，熱激處理芥菜芽苗的褪黑素含量為紫外處理的2.47 倍。發(fā)芽7 d 時，紫外處理和熱激處理芥菜芽苗的褪黑素含量均顯著高于CK(P＜0.05)，分別是CK的2.16 和1.92 倍。表明熱激處理4 和7 d、紫外處理7 d 可顯著提高芥菜芽苗的褪黑素含量，且發(fā)芽4 d 時芥菜芽苗的褪黑素含量最高(65 ng·g-1FW)。

圖6 紫外和熱激處理對芥菜芽苗褪黑素含量的影響Fig.6 Effect of UV and heat stress treatments on melatonin content of mustard sprouts

2.7 關(guān)鍵酶基因表達量

圖7 紫外和熱激處理對芥菜芽苗關(guān)鍵酶基因表達的影響Fig.7 Effects of UV and heat stress treatments on the expression of key enzyme gene in mustard shoots

由圖7-A 可知，與CK 相比，紫外處理和熱激處理顯著提高了芥菜芽苗TDC1 的表達量(P＜0.05)，但發(fā)芽4 d 時紫外處理和熱激處理芥菜芽苗TDC1 的表達量無顯著差異。由圖7-B 可知，發(fā)芽4 d 時，紫外處理與熱激處理芥菜芽苗TDC2 的表達量分別為CK 的14.80 和6.61 倍。與CK 相比，經(jīng)紫外處理和熱激處理發(fā)芽4 d 芽苗中T5H1 和T5H2 表達量均顯著上調(diào)(圖7-C、D)。發(fā)芽4 d 時，芽苗中SNAT1 表達量經(jīng)紫外處理顯著上調(diào)，但熱激處理對其無顯著影響(圖7-E)。發(fā)芽4 d 時，熱激處理芥菜芽苗SNAT2 的表達量顯著低于CK(P＜0.05)(圖7-F)。紫外處理和熱激處理使SNAT3 的表達量顯著下調(diào)(P＜0.05)(圖7-G)。發(fā)芽4 d 時，兩種處理芥菜芽苗SNAT4 的表達量分別為CK 的3.66 和2.19 倍(圖7-H)。發(fā)芽4 d 時，紫外處理和熱激處理芥菜芽苗ASMT1 的表達顯著上調(diào)(圖7-I)。發(fā)芽4 d 時，熱激處理芥菜芽苗ASMT2 的表達量相較紫外處理顯著下調(diào)(圖7-J)，而ASMT3 的表達量顯著上調(diào)(圖7-K)。表明紫外處理和熱激處理可通過影響芥菜芽苗中褪黑素合成關(guān)鍵酶基因的表達，進而調(diào)控芥菜芽苗中褪黑素的合成。

3 討論

植物在鹽[19]、高溫[20]、干旱[21]、紫外[22]等脅迫作用下，細胞會產(chǎn)生大量自由基，造成膜脂過氧化損傷，影響植物的生長與發(fā)育[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，芥菜芽苗經(jīng)紫外處理和熱激處理后，植株生長形態(tài)較小，芽長降低，表明芥菜芽苗生長受到抑制。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，過氧化氫與可溶性蛋白含量的變化是對逆境做出的有效生理反應(yīng)，激活內(nèi)源抗氧化防護系統(tǒng)，從而減輕或緩解逆境傷害。總抗氧化能力是反映機體抗氧化作用的綜合性指標(biāo)[24-26]。發(fā)芽期間，紫外處理和熱激處理芥菜芽苗的總抗氧化能力和可溶性蛋白含量均顯著高于CK，處理7 d 時，熱激處理芥菜芽苗的可溶性蛋白含量顯著高于紫外處理，這與經(jīng)干旱與聚乙二醇脅迫處理的小麥幼苗中相關(guān)指標(biāo)結(jié)果一致[27]。研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽可通過巰基與自由基結(jié)合，將自由基轉(zhuǎn)化成易代謝的酸類物質(zhì)，從而加速自由基代謝，因此谷胱甘肽過氧化物酶活性也是判斷芽苗受脅迫程度的重要指標(biāo)[28]。發(fā)芽7 d 時，激處理和紫外處理芥菜芽苗的谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著高于CK，表明紫外處理和熱激處理會抑制芥菜芽苗的生長，并可能通過自身的調(diào)控作用應(yīng)對外界環(huán)境的脅迫。

Tan 等[29]發(fā) 現(xiàn)，在強中波紫外線(ultraviolet radiation B，UV-B)輻射條件下，水葫蘆的褪黑素含量顯著提高。Shi 等[30]研究表明，熱脅迫處理可顯著提高擬南芥葉片的褪黑素含量。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽期間，熱激處理4 和7 d、紫外處理7 d 時芥菜芽苗的褪黑素含量均顯著高于CK，且發(fā)芽4 d 時芥菜芽苗中褪黑素含量最高；另外，紫外處理和熱激處理提高了芥菜芽苗中異硫氰酸酯的含量，且熱激處理的效果更明顯。表明紫外處理和熱激處理可富集芥菜芽苗中的褪黑素，同時提高芽苗中異硫氰酸酯的含量，進而提升功能性食品的品質(zhì)[31]。植物體內(nèi)的褪黑素是由色氨酸經(jīng)色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)的催化轉(zhuǎn)化為色胺，然后經(jīng)過色氨酸5-羥化酶(tryptophan 5-hydroxylase，T5H)催化色胺形成5-羥色胺，再由血清素N - 乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin N-acetyltransterase，SNAT)催化5-羥色胺轉(zhuǎn)化為N-乙酰基-5-羥色胺，最后經(jīng)乙?；逅丶谆D(zhuǎn)移酶(hydroxyindole-Omethyltransferase，ASMT)或羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(hydroxyindole-O-methyltransferase，HOMT)作用將N-乙?；?5-羥色胺形成褪黑素[8]。不同觀察時間點(4 d 和7 d)，褪黑素合成關(guān)鍵酶基因表達量變化趨勢并不相同，這與不同關(guān)鍵酶在不同階段發(fā)揮作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，TDC的表達量升高時褪黑素含量也升高，說明其可以促進褪黑素的合成，這與Zhao 等[32]的研究結(jié)果一致。表明紫外處理和熱激處理可顯著影響褪黑素合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達，從而提高芥菜芽苗中褪黑素的含量，實現(xiàn)褪黑素的富集。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，芥菜芽苗發(fā)芽期間，紫外處理和熱激處理抑制了芥菜芽苗的生長發(fā)育，芽苗中過氧化氫含量降低，可溶性蛋白質(zhì)含量、谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力提高，異硫氰酸酯含量和褪黑素含量上升。在觀察時間點(發(fā)芽4 d 和7 d)，熱激處理4 d時芥菜芽苗中褪黑素含量最高，為65 ng·g-1FW，說明熱激處理是富集褪黑素的有效方式。