魏麗梅 鄒小文 徐婷璐 袁文濤 魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045)

水稻紋枯病是由擔(dān)子類立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染水稻引起的重要真菌病害之一[1]。近年來，由于氮肥使用量增加以及田間土壤中菌核數(shù)量增多，導(dǎo)致水稻紋枯病廣泛傳播[2]。目前，化學(xué)農(nóng)藥是水稻紋枯病菌的有效防治方法，然而高劑量農(nóng)藥殘留，不僅會增加植物病害抗性，而且危害環(huán)境，威脅人類健康。隨著合成農(nóng)藥的開發(fā)和回收成本不斷上升，人們更愿意選擇以生物方式開發(fā)、價格更低廉且環(huán)境友好型的防治產(chǎn)品。生物防治能夠利用微生物及其所產(chǎn)活性物質(zhì)來防治植物病害，開發(fā)天然生物產(chǎn)品對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、人體健康具有重要意義[3]。

研究表明，放線菌會產(chǎn)生大量具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和豐富活性的次級代謝產(chǎn)物，是產(chǎn)活性物質(zhì)最多的一類生防菌。鏈霉菌屬(streptomyces)及其相關(guān)類群被認(rèn)為是主要的放線菌屬，廣泛用于植物病害生物防治[4-5]。鏈霉菌能夠產(chǎn)生多種抗生素、酶抑制劑、植物激素等活性物質(zhì)，對提高植物的抗病、抗逆性能具有重要作用[6-8]。如 Harikrishnan 等[9]獲得的鏈霉菌VSMGT1014 的乙酸乙酯提取物具有抑制真菌菌絲生長、孢子和菌核萌發(fā)的作用。王巖等[10]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌菌株F-1 對水稻紋枯病菌有顯著的拮抗作用，其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致水稻紋枯病菌頂端菌絲彎曲，菌絲體皺縮畸形。于冰等[11]研究表明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的胞外代謝產(chǎn)物豐加霉素對黃瓜立枯絲核菌的菌絲生長和菌核形成均有明顯的拮抗作用。生防鏈霉菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠造成病原菌體氧化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲、細(xì)胞原生質(zhì)體失活，達(dá)到抑制病原微生物的作用[12]。目前鏈霉菌產(chǎn)活性物質(zhì)作用于真菌細(xì)胞膜和菌體抗氧化系統(tǒng)的研究相對較少，鏈霉菌應(yīng)用于植物病害防治上的研究也鮮有報道。

鏈霉菌JD211 是本研究前期分離得到的一株產(chǎn)灰褐色孢子的鏈霉菌，經(jīng)鑒定為奈良鏈霉菌(Streptomyces naraensis)，產(chǎn)環(huán)己酰亞胺類物質(zhì)，命名為農(nóng)抗211，可顯著抑制水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、煙草黑脛病菌、根霉等多種植物病原真菌的生長[13]。李張[14]發(fā)現(xiàn)，0.99 μg·mL-1的農(nóng)抗211 能夠促進(jìn)水稻種子萌發(fā)，而62 μg·mL-1的農(nóng)抗211 則能夠提高水稻結(jié)實(shí)率，增加產(chǎn)量，并且能誘導(dǎo)水稻對紋枯病產(chǎn)生抗性，調(diào)控水稻葉片相關(guān)抗性酶活和抗逆性物質(zhì)含量，從而減少紋枯病對水稻的侵害。邵正英等[15]發(fā)現(xiàn)將鏈霉菌JD211 菌劑施入水稻根際土壤后，能有效增加水稻抗性，抑制病原菌的進(jìn)一步侵染，有效提高水稻對稻瘟病的抗性。雖然關(guān)于農(nóng)抗211 在水稻抗病、促生方面的研究較多，但其對病原真菌抑菌的作用機(jī)理尚不明確。本試驗(yàn)通過農(nóng)抗211 作用水稻紋枯病菌菌絲，旨在明確其對病菌細(xì)胞膜及其抗性酶活的影響，為應(yīng)用鏈霉菌JD211防治水稻真菌病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株:鏈霉菌JD211(StreptomycesJD211)，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地實(shí)驗(yàn)室提供；水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)，由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈。

農(nóng)抗211 的制備:參照李張[14]的方法。稱取適量的固體菌劑與蒸餾水以質(zhì)量體積比1 ∶1浸提24 h，8 000 r·min-1離心，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌得到無菌的農(nóng)抗211，通過與納他霉素對水稻紋枯病的對抗試驗(yàn)，可得到農(nóng)抗211 相應(yīng)效價濃度為15.8 μg·mL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(potato sucrose agar，PSA):去皮土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(potato sucrose broth，PSB)培養(yǎng)基:不含瓊脂的PSA 培養(yǎng)基。米飯固體培養(yǎng)基:早秈米500 g，葡萄糖5 g，麩皮20 g；先將大米浸泡16 ～24 h，蒸煮成米飯，加入適量葡萄糖均勻拌在米飯中，加入麩皮，加水混勻輕搓，裝入蘑菇瓶(500 mL 菌種組培玻璃瓶)中，121℃高壓滅菌1 h，備用。

1.3 方法

1.3.1 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞膜通透性 采用Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA 平板上的水稻紋枯病菌菌塊，接種于50 mL PSB 培養(yǎng)液中，于28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，處理組加入備用的農(nóng)抗211 藥液使其終濃度為4.00 μg·mL-1，以等量無菌水為對照(CK)。培養(yǎng)24 h 后取少量菌體加入pH 值7.2 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗數(shù)次，每次3 min。用70%乙醇4℃下固定菌絲1 h，再用PBS 漂洗3 次，每次3 min。除去PBS 后，加入0.5 mL 50 μg·mL-1的熒光染料碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，4℃避光20 min。用PBS 沖洗多余的染液。置熒光顯微鏡于綠光激發(fā)波長465 ～495 nm 下觀察。每個重復(fù)試驗(yàn)中取2 個平行進(jìn)行觀察[16]。

1.3.2 對水稻紋枯病菌胞外電導(dǎo)率的影響 將紋枯病菌接種于PSA 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d，用打孔器打取6 塊菌絲塊，接種于50 mL PSB 培養(yǎng)液中，于28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，取出菌絲，用滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗并抽干水分。稱取2 g 洗凈的菌絲放入三角瓶中，加入濃度分別為0、0.46、4.00 μg·mL-1的農(nóng)抗211藥液，每處理設(shè)置一個藥劑對照(CK)，即只含各濃度農(nóng)抗211 而不加菌絲，置于28℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8 h 測定電導(dǎo)率。每處理試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 丙二醛含量測定 Φ 6.0 mm 打孔器打取PSA平板上的水稻紋枯病菌菌塊，接種于50 mL PSB 培養(yǎng)液中，于28℃、160 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，處理組加入不同濃度的農(nóng)抗211 無菌藥液使其終濃度為0.63、1.26、2.53、5.06 μg·mL-1，以等量無菌水為對照(CK)，培養(yǎng)48 h，無菌蒸餾水沖掉菌絲上的培養(yǎng)基，用濾紙吸干水分。稱取1 g 菌絲，加入2 mL 10%的三氯乙酸，研缽中研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，再用4 mL 10%的三氯乙酸沖洗研缽，重復(fù)2 次，合并提取液。10 000 r·min-1離心15 min 收集上清液。采用硫代巴比妥酸法[17]測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.4 總脂質(zhì)含量測定 采用磷香草醛法測定不同處理下水稻紋枯病菌總脂質(zhì)含量[18]，菌絲培養(yǎng)及處理方法同1.3.3。分別稱取0.5 g 干燥菌絲在液氮下進(jìn)行研磨；加入4 mL 甲醇∶氯仿∶水(2 ∶1 ∶0.8，v ∶v ∶v)，劇烈震蕩后靜置40 min。取出較低相位(下層)含有脂質(zhì)的混合液與0.2 mL 生理鹽水(0.9%)混合，4℃、4 000 r·min-1條件下離心10 min，取0.8 mL 提取液加入到0.2 mL 氯仿和0.2 mL 濃硫酸中，沸水中加熱10 min，室溫下冷卻。向各提取液中分別加入5 mL 磷光體香草醛素，室溫下保持10 min。最后用紫外分光光度計(jì)在520 nm 波長處測定顯色染料的吸光度值。用膽固醇做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總脂質(zhì)含量。每個處理3 次重復(fù)，取均值。

1.3.5 抗氧化酶活性測定 菌絲培養(yǎng)及處理方法同1.3.3，稱取1 g 菌絲，加入5 mL 預(yù)冷的0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 [2%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，pH 值7.8]及少量石英砂冰浴研磨成勻漿。4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用磷酸緩沖液定量至10 mL 即為粗酶液，用于酶活性測定，水稻紋枯病菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(ployphe-noloxidase，PPO) 活性測定參考文獻(xiàn)[19-21]；取0.2 g 菌絲置于研缽中，加10 mL 預(yù)冷的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 值7.0)，于冰上充分研磨后，4℃、10 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液用于水稻紋枯病菌脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性測定，測定方法參考文獻(xiàn)[22]；取0.5 g 菌絲，加入2 mL 預(yù)冷的0.05 mol·L-1硼酸緩沖液[含5 mmol·L-1巰基乙醇，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和1% PVP，pH 值8.8]及少量石英砂于預(yù)冷的研缽中，冰浴下研磨成漿，4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，用緩沖液定量至5 mL，用于苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)活性測定[23]。以上處理測定時均以添加等量相應(yīng)緩沖液為空白對照用于調(diào)零，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌絲體表面形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的影響

熒光染料PI 是一種能夠?qū)NA 進(jìn)行染色的細(xì)胞核染色試劑[16]，可通過破損細(xì)胞或者死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合染色，熒光顯微鏡下顯現(xiàn)紅色熒光。對照組菌絲基本未見熒光；藥液處理組菌絲呈現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光。表明經(jīng)農(nóng)抗211 處理后，水稻紋枯病菌細(xì)胞膜被破壞，通透性增加，PI 染料進(jìn)入細(xì)胞，核酸被染色，細(xì)胞膜通透性的改變引起細(xì)胞內(nèi)容物泄露，影響水稻紋枯病菌的正常生長(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下菌絲熒光Fig.1 Visualization of hyphae under fluorescence microscopy

2.2 農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌胞外電導(dǎo)率的影響

由圖2 可知，處理2 h 時，0.46 和4.00 μg·mL-1藥液處理組胞外電導(dǎo)率分別為53.10、217.67 μs·cm-1，顯著高于對照(2.53 μs·cm-1)(P＜0.05)，處理10 h 時，0.46 和4.00 μg·mL-1藥液處理組胞外電導(dǎo)率達(dá)到最高值，分別為56.43、234.90 μs·cm-1，比處理2 h 分別增加了6.27%和12.96%，隨著藥液濃度的增加，水稻紋枯病菌胞外電導(dǎo)率也增加，說明農(nóng)抗211 可作用于水稻紋枯病菌菌絲細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

圖2 不同濃度農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌胞外電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on extracellular conductivity of R. solani

2.3 農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌MDA 含量的影響

MDA 是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是膜脂質(zhì)過氧化的一個重要指標(biāo)。藥液處理組菌絲MDA 含量隨著藥液處理濃度的增加而增加，且藥液濃度大于0.63 μg·mL-1時，與CK 相比，MDA 含量分別增加了26.63%、54.53%和102.34%，表明一定濃度農(nóng)抗211能夠引起水稻紋枯菌絲發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡(圖3-A)。

2.4 農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌總脂質(zhì)含量的影響

脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動性和增加細(xì)胞膜穩(wěn)定性的功能[24]。藥液處理組菌絲總脂質(zhì)含量均比CK 低，總脂含量48.46 mg·g-1，經(jīng)5.06 μg·mL-1藥液處理后的菌絲總脂質(zhì)減少了20.84%。總脂質(zhì)含量的降低表明脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性降低，進(jìn)一步影響了細(xì)胞膜的完整性(圖3-B)。

圖3 不同濃度農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌丙二醛含量(A)和總脂質(zhì)含量(B)的影響Fig.3 Effect of different concentration of antifungalmycin 211 on intracellular malondialdehyde content (A) and total lipids content (B) of R. solani

2.5 農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌抗氧化酶活性的影響

由表1 可知，與CK 相比，藥液濃度為0.63 μg·mL-1時，SOD、CAT 和POD 活性升高；當(dāng)藥液濃度大于0.63 μg·mL-1時，3 種酶活性均隨著濃度增加而降低；PPO 活性隨著藥液濃度增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢；當(dāng)藥液濃度為1.26 μg·mL-1時，PAL 活性明顯升高，PAL 和PPO 可維持菌體抗氧化能力。當(dāng)藥液濃度大于1.26 μg·mL-1時，PAL 活性急劇下降，明顯受到抑制。藥液濃度達(dá)到5.06 μg·mL-1時，酶活性與CK相比均受到明顯抑制；LOX 活性隨著濃度的增大而增大。結(jié)果表明，低濃度的藥液處理能激活SOD、CAT和POD，高效清除生物體內(nèi)的活性氧，提高抗氧化能力，同時CAT 活性也增強(qiáng)，催化分解菌體內(nèi)過量的H2O2，減少氧化傷害，起到防御作用。藥液濃度達(dá)到5.06 μg·mL-1時，5 種抗氧化酶活性均受到明顯抑制，菌體抗氧化系統(tǒng)遭嚴(yán)重破壞，LOX 活性最強(qiáng)，表明膜脂過氧化程度最嚴(yán)重，菌體細(xì)胞過氧化嚴(yán)重引起代謝紊亂，細(xì)胞逐漸凋亡。

3 討論

目前關(guān)于生防菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對植物病原真菌的作用機(jī)制的研究主要是影響真菌細(xì)胞壁合成，破壞細(xì)胞膜完整性，抑制生物大分子的合成，以及影響細(xì)胞能量代謝系統(tǒng)等[12]。細(xì)胞膜是抑菌物質(zhì)抗菌的作用位點(diǎn)之一。本研究中，PI 染色試驗(yàn)表明農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌細(xì)胞膜通透性有影響，菌體細(xì)胞膜的透性被破壞，菌絲皺縮。菌體胞外電導(dǎo)率升高，離子外流，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，胞質(zhì)外流，菌絲生長受到抑制。這與前期鏈霉菌702 菌株抗真菌單體組分DZP8作用于水稻紋枯病菌細(xì)胞膜結(jié)果類似[24]。

表1 不同濃度農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響Table 1 Effect of different concentration of antifungalmycin JD211 on antioxidant enzyme activity of R. solani

本研究結(jié)果表明，隨著農(nóng)抗211 作用濃度增加，細(xì)胞膜受到破壞，抗氧化系統(tǒng)被激發(fā)，SOD、POD 和CAT活性開始增強(qiáng)，用于緩解膜過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞。SOD 和POD 能夠催化超氧化物陰離子自由基反應(yīng)分解，從而減輕細(xì)胞的氧化損傷，提高抗氧化能力[25]。CAT 能夠催化細(xì)胞發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的H2O2分解，減少H2O2對細(xì)胞的毒害[26]。SOD、POD 和CAT作為抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類，其活性在一定程度上能反映細(xì)胞的抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥液濃度為5.06 μg·mL-1時，水稻紋枯病菌SOD、POD、CAT、PAL和PPO 防御酶的活性均較CK 顯著降低，LOX 活性顯著增強(qiáng)，表明抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。LOX 能夠參與自由基產(chǎn)生、通透性改變和膜脂質(zhì)過氧化等過程[27]，其活性能夠反映膜脂質(zhì)過氧化程度。PAL 是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，參與酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)合成，是一種防御酶[28]；PPO 能轉(zhuǎn)化酚類化合物并氧化脫氫生成鄰苯醌[29]，鄰苯醌參與物質(zhì)合成，保持菌體正常生理代謝。PAL 和PPO 在一定程度上也可以反映生物的抗氧化能力?？寡趸到y(tǒng)被激發(fā)過程中，細(xì)胞總脂質(zhì)含量降低，MDA 含量不斷上升，膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，拮抗真菌效果明顯。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌細(xì)胞膜的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)農(nóng)抗211 對水稻紋枯病菌有較好的抑制作用，其作用機(jī)制是有效破壞水稻紋枯病菌菌絲體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，增加細(xì)胞膜通透性，致使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，脂質(zhì)含量減少，嚴(yán)重破壞菌體抗氧化系統(tǒng)，從而導(dǎo)致水稻紋枯病菌的菌絲體生長被抑制甚至死亡，從而達(dá)到抑制真菌病害的作用。本研究結(jié)果為鏈霉菌JD211 的生物防治應(yīng)用提供了理論依據(jù)。