李 捷，張 峰，黃菁菁，丁立平，楊 方 ，姚清華

（1. 福州海關技術中心，福建 福州 350001；2. 榕城海關綜合技術服務中心，福建 福州 350300；3. 福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】茶與咖啡、可可并稱世界三大非酒精性飲料，具有抗癌、提高機體抗氧化能力和增強免疫的功效，備受消費者青睞，也是我國重要的出口創(chuàng)匯農產品之一[1]。小綠葉蟬、茶尺蠖、茶麗絞象甲、茶餅病等病蟲害是影響茶葉產量的重要因素之一，為了控制病蟲害、雜草及提高產量，茶農常常在茶園中施用農藥[2?3]。近年來，茶葉中的農藥殘留問題日益受到消費者的關注?！厩叭搜芯窟M展】國內外學者就茶葉中的農藥殘留檢測、遷移規(guī)律和風險評估等進行了大量的研究[4?7]，其中精確定量分析茶葉中農藥殘留是其他研究的基礎。目前，茶葉中農藥殘留分析的樣品凈化方法多是采用固相分散萃取技術，N-丙基乙二胺填料（N-propyl ethylene diamine, PSA）和石墨化碳黑（GCB）是常用的關鍵凈化材料，主要用于去除色素、有機酸等干擾物質[8?10]。但是PSA 和GCB 價格相對較高，大幅度增加了檢測成本；GCB 對多菌靈等平面型結構的農藥具有較強的吸附性，對測定結果的準確性具有一定影響[11]。【本研究切入點】納米Fe3O4，具有比表面積大、吸附位點多、吸附特異性強等優(yōu)點[12?14]，對茶葉中色素的選擇性吸附可能優(yōu)于PSA，且更利于平面型結構的農藥測定，可大幅度提高樣品凈化效率和測定準確性?！緮M解決的關鍵問題】本研究以多菌靈、三環(huán)唑2 種典型的平面型結構農藥和嘧霉胺、吡蟲啉、啶蟲脒、滅多威、噻蟲嗪等5 種茶葉中常見的農藥殘留種類為檢測對象，將納米Fe3O4應用于農藥殘留檢測前處理，以期建立基于納米Fe3O4-磁固相分散萃取-高效液相色譜-串聯質譜的農殘檢測方法，降低檢測成本，縮短操作時間，對茶葉質量安全管控具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（Agilent 1200-6460，美國Agilent 公司），配備ESI 離子源；SYNERY UV 超純水器（美國Milipore 公司）；IKA-MS3 漩渦振蕩器（德國IKA 公司）；氮吹儀（HN200，濟南海能儀器股份有限公司）；TDL-40B 離心機（上海安亭科學儀器廠）。50 mL 具塞聚丙烯離心管（德國Greiner 公司）；石墨化碳黑固相萃取填料（80～100目，美國Agilent 公司）；納米四氧化三鐵（98%，50～100 nm，阿拉丁試劑有限公司）；乙腈、甲苯（色譜純，德國Merck 公司）；無水硫酸鎂、無水氯化鈣、氯化鈉（分析純，上海試一化學試劑有限公司）；有機濾膜（0.22 μm，天津津騰有限公司）。多菌靈、嘧霉胺、三環(huán)唑、吡蟲啉、啶蟲脒、滅多威、噻蟲嗪標準物質購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，含量均為100 μg·mL-1。

1.2 標準溶液配制

準確移取7 種農藥標準溶液各0.500 mL 于50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，配制成1.00 μg·mL-1的混合標準儲備液，使用時再用乙腈配制成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品提取與凈化

稱取2 g（精確至0.01 g）粉碎并混勻的茶葉樣品，置于50 mL 具塞塑料離心管中，加入3 mL 飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻并靜置10 min 后準確加入20 mL乙腈，蓋緊瓶蓋，再渦旋振蕩30 s，超聲提取60 min，4 000 r·min?1離心5 min 后，將10 mL 上清液轉移至另一個塑料離心管中，加入2 g 無水氯化鈣，渦旋振蕩1 min，4 000 r·min?1離心5 min 后 移取6 mL 上清液至另一玻璃試管中，加入0.6 mL 甲苯和0.3 g 納米Fe3O4，渦旋振蕩30 s 后將磁鐵置于玻璃離心管底部，待納米Fe3O4全部吸附于玻璃試管底部后，準確移取5.5 mL 上清液于45 ℃下氮吹至干，1 mL 乙腈+水（1+1）復溶，過0.22 μm 有機濾膜，待進樣分析。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱Phenomenex Luna C8（150 mm × 2.0 mm × 3.0 μm）；流動相A 為含0.1 %甲酸（v/v）和5 mmol·L?1乙酸銨的水；流動相B 為乙腈；梯度洗脫：初始為70 %的A，30 %的B，保持0.5 min；0.5～3.0 min，A 線性變換為10 %，B 變換為90 %；3～6 min，保持10%的A，90%的B；6～9 min，A 線性變換為70 %，B 變換為30 %，保持3 min；全程共13 min。流速：0.3 mL·min?1；進樣量：5 μL；柱溫：35℃。

1.4.2 質譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細管電壓：3 500 V；氣簾氣溫度：325 ℃；氣簾氣流速：8 mL·min?1；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：12 mL·min?1；多反應監(jiān)測（MRM）方式檢測；7 種待測農藥的保留時間、母離子、特征離子碎片、碰撞電壓及保留時間見表1。

表 1 7 種農藥的液相色譜質譜分析參數Table 1 LC-MS/MS testing parameters for 7 pesticides

2 結果與分析

2.1 納米Fe3O4 對茶葉的凈化效果

無水氯化鈣不但具有無水硫酸鎂的吸水作用，還能對茶葉提取液中的色素進行初步的凈化，降低后續(xù)凈化的難度，因此本試驗使用無水氯化鈣代替無水硫酸鎂作為除水劑。但是經過無水氯化鈣初步凈化后，提取液仍有明顯的顏色，本研究采用納米Fe3O4進行二次凈化。圖1 為經過MgSO4與CaCl2初步凈化，以及CaCl2初步凈化并納米Fe3O4二次凈化的茶葉提取液在可見光區(qū)波長400～780 nm 的吸光度曲線。結果表明，CaCl2去除茶葉色素的能力要優(yōu)于MgSO4，而在添加納米Fe3O4后，提取液中的色素含量更是大幅度降低，納米Fe3O4可以有效去除色素。以農藥含量為50 μg·kg?1的茶葉樣品為檢測對象，納米Fe3O4組7 種農藥的回收率均明顯高于農藥殘留檢測GCB 組（圖2）。

圖 1 提取液經不同材料凈化后的色素變化Fig. 1 Variation on pigments in tea extracts after treatment of different pigment-removing materials

2.2 納米Fe3O4 用量的優(yōu)化

納米Fe3O4使用量對農藥回收率的影響如圖3示，平面結構農藥多菌靈和三環(huán)唑的回收率隨著Fe3O4用量增加逐漸下降。Fe3O4用量高于300 mg時，回收率低于70%。綜合考慮到7 種農藥的回收率均要滿足殘留檢測的要求，將Fe3O4用量定為300 mg。

圖 2 不同凈化材料對7 種農藥的回收率影響Fig. 2 Recovery rate on 7 pesticides of newly developed method with pretreatment using different pigment-removing materials

2.3 基質效應的考察

在電噴霧離子源進行離子化時，基質和目標化合物會有競爭關系，包括基質增強效應和基質抑制效應[15]。試驗配制0、1、5、10、20、50 ng·mL?16個質量濃度的基質標準工作溶液及同濃度的溶劑標準工作溶液，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制工作曲線，以（基質標準工作曲線斜率/溶劑標準工作曲線斜率）×100% 計算基質效應（ME）。分別使用納米Fe3O4和GCB 進行二次凈化后，茶葉中7 種農藥殘留的基質效應如圖4 示，2 組基質工作曲線和標準工作曲線斜率比值均低于50%，表明存在明顯的基質效應。因此，本方法采用基質匹配曲線對7 種農藥殘留進行定量分析。但相比于GCB，Fe3O4可以有效降低茶葉樣品在液相色譜質譜聯用儀上的基質抑制效應。

圖 3 納米Fe3O4 用量的優(yōu)化Fig. 3 Optimization on Fe3O4 nanoparticle usage

圖 4 凈化材料對茶葉中農藥檢測基質效應的影響Fig. 4 Effect of pigment-removing materials on determination of 7 pesticides in tea

2.4 色譜與質譜條件的優(yōu)化

以含0.1 % 甲酸的水作為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫的方式，對7 種農藥進行MRM條件優(yōu)化，7 種農藥均可在正離子模式下獲得[M+H]+的母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，分析碎片離子信息，選擇2～3 對響應值高、基線噪音值低的離子對作為定性離子對，選擇其中信號最強、干擾最小的定性離子對作為定量離子對。

進一步對液相色譜條件進行優(yōu)化，發(fā)現使用Phenomenex Luna C8 色譜柱代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18 色譜柱進行分離，多菌靈的峰形得到明顯的改善；另外當采用含0.1 %甲酸和5 mmol·L?1乙酸銨的水替代含0.1 %甲酸的水作為流動相A 后，連續(xù)對混合標準溶液進樣，峰面積的RSD均較小，故將流動相A 改為含0.1 %甲酸和5 mmol·L?1乙酸銨的水。7 種農藥的總離子流圖見圖5。

圖 5 50 μg·L?1 的7 種農藥的標準溶液的總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatograms on 50 μg·L?1 solutions of 7 pesticides

2.5 方法的評價

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 配制質量濃度水平分別為0、1、5、10、20、50 ng·mL?1的基質混合標準工作溶液，以峰面積A 與對應目標物質量濃度（X，ng·mL?1）繪制7 種農藥的基質標準工作曲線，線性相關系數（R2）均高于0.995，線性回歸方程和相關系數見表2。在空白茶葉樣品中添加含7 種目標物的標準溶液，制得不同目標物含量的加標樣品，按優(yōu)化條件進行測定，分別以3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比計算方法的檢出限和定量限。該方法的檢出限為0.15～0.60 μg·kg?1，定量限范圍為0.5～2.0 μg·kg?1。方法線性范圍可以滿足實際茶葉樣品檢測的需要。

2.5.2 方法的準確度和精密度 在茶葉空白樣品中添加混合標準溶液，獲得目標物含量為5、10、50 ng·g-13 個加標水平，按優(yōu)化后的方法重復測定6 次。茶葉樣品中7 種農藥的加標回收率及精密度（RSD）如表3 示，茶葉中添加不同水平7 種農藥的回收率為71.6%～107.7 %，相對標準偏差（RSD）為3.95%～13.62 %，表明該方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足茶葉中這7 種農藥殘留量的分析要求[16]。

表 2 方法的線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, R2, LODs, and LOQs on detections of 7 pesticides by newly developed detection method

表 3 7 種農藥的加標回收率及精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and RSDs on spiked pesticides of newly developed detection method (n=6)

3 討論與結論

在使用有機試劑對茶葉等干性農產品中農藥殘留目標物提取前通常需要加水浸泡樣品，以此提高中強極性農藥目標物的提取效率[17]。但是，同時會導致茶葉中色素、茶多酚、咖啡堿、有機酸等水溶性雜質大量溶出，造成后續(xù)凈化的難度增大[17]。無水硫酸鎂由于其具有良好吸水性能被廣泛應用于QuEChERS 等植物源性食品農藥殘留檢測的前處理[18?19]。但是無水硫酸鎂對于茶葉中的主要雜質沒有凈化效果，而無水氯化鈣除了吸水性外，還能凈化茶多酚、咖啡堿、有機酸及色素等多種雜質，本研究使用無水氯化鈣代替無水硫酸鎂對茶葉農藥殘留提取液中多種雜質進行初步凈化，取得良好的凈化效果。其可能性的機理是Ca2+有促進茶湯沉淀形成的作用，且隨著Ca2+濃度的增加，沉淀量相應增加[20]。

在對色素含量較高的農產品中農藥殘留進行分析時，由于具有平面結構的石墨化碳黑（GCB）對色素等具有類似平面結構的雜質有極強的吸附作用，常在前處理時用作色素凈化吸附劑[21]。但其對多菌靈和三環(huán)唑等具有類似平面結構的農藥也具有極強的吸附作用，導致這類農藥經過GCB 凈化后的回收率極低，難以滿足殘留檢測分析的要求。而本研究所用的納米Fe3O4不但能凈化色素，對農藥尤其是平面結構農藥的吸附作用明顯低于GCB，可以有效解決這一技術難題。同時，由于納米Fe3O4具有磁性，可以利用外加磁場進行分離，效率遠高于離心分離技術，大幅度提高了檢測效率[22]。因此，納米Fe3O4更加適用于茶葉中平面結構農藥的凈化。