吳靈芝，宋 璐，余天成，李保珍，樊金華

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西太谷030801；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原030000）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）屬于子囊菌門（Ascomycota）肉座菌目（Hypocreales）蟲(chóng)草菌科（Cordycipitaceae）白僵菌屬（Beauveria），能寄生于700 多種昆蟲(chóng)[1]，是一種廣譜性的昆蟲(chóng)病原真菌[2]。雖然球孢白僵菌能引起家蠶白僵病，但使用得當(dāng)，也將是最有前景的生防菌種之一[3-5]，能夠廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)防治[6-7]?，F(xiàn)階段，白僵菌制劑已經(jīng)應(yīng)用于防治亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[8]、油松毛蟲(chóng)（Dendrolimus tabulaeformis）[9]、煙粉虱（Bemisia tabaci）[10]、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[11]、蚜蟲(chóng)（Aphidoidea）[12]、蝗蟲(chóng)[13]等眾多農(nóng)林害蟲(chóng)[14]。但白僵菌菌株種類眾多，篩選出具有更高致病力的菌株，并且在最佳用藥時(shí)期以最佳濃度應(yīng)用于生防，仍然是需要探索的問(wèn)題[15]。

球孢白僵菌的分生孢子在接觸昆蟲(chóng)后，容易在高溫高濕的環(huán)境下萌發(fā)，萌發(fā)的菌絲通過(guò)表皮侵入寄主昆蟲(chóng)的體內(nèi)并生長(zhǎng)、繁殖，產(chǎn)生大量的菌絲和有毒代謝產(chǎn)物[1，16]。白僵菌以體壁侵染的方式感染家蠶時(shí)，發(fā)現(xiàn)其分生孢子接觸家蠶表皮后10 h 內(nèi)萌發(fā)，菌絲能在家蠶體內(nèi)快速生長(zhǎng)繁殖致使養(yǎng)分和水分被迅速消耗，表皮開(kāi)始出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，最終僵硬死亡[17]。白僵菌侵染寄主昆蟲(chóng)，除了體表侵染外，還采用口服和背部注射等方法，背部注射法可使白僵菌更快地進(jìn)入家蠶體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)。

昆蟲(chóng)病原菌侵染昆蟲(chóng)后，能夠引起其食量下降、排便異常、嘔吐等行為變化[18-19]，最終影響其生長(zhǎng)發(fā)育。白耀宇等[20]研究表明，大腸桿菌對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體質(zhì)量具有抑制作用。TEFERA 等[21]研究了白僵菌感染二化螟（Chilo partellus）幼蟲(chóng)，證明菌株在處理后1～4 d 顯著影響其取食。MOORE 等[22]研究表明，沙漠蝗（Schistocerca gregaria）取食量的減少與綠僵菌的濃度和劑量密切相關(guān)。

家蠶（Bombyx mori）是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的并且研究廣泛的鱗翅目模式昆蟲(chóng)，是易于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。本研究將球孢白僵菌以背部平行注射的方法侵染家蠶，探討球孢白僵菌菌株TST、FDB 和BF 對(duì)家蠶卵和幼蟲(chóng)的致病力及對(duì)家蠶幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為揭示球孢白僵菌對(duì)家蠶的致病機(jī)理及更多高效生防真菌制劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)[23]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 試驗(yàn)所用家蠶為Nistari 品系，西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院贈(zèng)送。

1.1.2 供試菌株 球孢白僵菌菌株TST，分離自桃小食心蟲(chóng)（Carposina sasakii）越冬蟲(chóng)尸上[24]；球孢白僵菌菌株BF，分離自光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）蟲(chóng)尸上[25]；球孢白僵菌菌株FDB，分離自帕克阿扁松葉蜂（Acantholyda）蟲(chóng)尸上[26]，均保存在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林生物顯微技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 儀器 GDN-300E-4 型光照培養(yǎng)箱（寧波樂(lè)電儀器制造有限公司）、DL-CJ-IND 型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限責(zé)任公司）、78-2 型磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、LS-35HD 型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、SB-20002 型電子天平（海寧市盛博衡器有限公司）、ZEISS 型光學(xué)顯微鏡（上海永匯實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、徠卡M205C 型超景深體視顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶飼養(yǎng) 家蠶用食品級(jí)塑料盒（1 500 mL）飼養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中，溫度為（25±1）℃，5 齡家蠶的相對(duì)濕度控制在70%，光照周期12L∶12D。越年蠶卵在4 ℃冰箱保存，最長(zhǎng)不超過(guò)60 d。家蠶飼養(yǎng)所用桑葉采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站，用自封袋密閉保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 球孢白僵菌分生孢子懸液制備 在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)刮取少量球孢白僵菌孢子，以平板劃線法接種到新的PDA 培養(yǎng)基上[27]，然后用封口膜密封，在（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中，光周期12L∶12D，倒置培養(yǎng)10 d 采收。將培養(yǎng)好的球孢白僵菌在無(wú)菌條件下刮取適量孢子，置于盛有0.05%吐溫-80 的三角瓶中，磁力攪拌器上攪拌10 min，使孢子均勻分散，后用2 層紗布過(guò)濾除去菌絲，即為待測(cè)孢子懸液。采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)懸液孢子數(shù)備用。

1.2.3 球孢白僵菌對(duì)家蠶卵的致病力測(cè)定 家蠶產(chǎn)卵當(dāng)天，分別取10 μL 濃度為1×107個(gè)/mL 的TST、FDB、BF 菌株的孢子懸浮液滴到產(chǎn)卵紙上有卵的地方，并將其周圍浸濕，每組處理30 粒卵，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將處理后的卵放置在培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)卵的孵化數(shù)，直至全部孵化。對(duì)照組用等量的0.05%吐溫-80 處理。

1.2.4 球孢白僵菌對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的致病力測(cè)定 挑取健康的5 齡第3 天家蠶幼蟲(chóng)，先用75%酒精將注射處體壁消毒，然后置于鋪有保鮮膜的冰盒中10 min后利用微量注射器將5 μL 不同菌株孢子懸液從背部注射家蠶體內(nèi)。新鮮桑葉飼養(yǎng)，每隔24 h 觀察并記錄蟲(chóng)體死亡情況，計(jì)算累計(jì)死亡率和半數(shù)致死時(shí)間（LT50）。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每組10 頭試蟲(chóng)。將死亡的家蠶轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，當(dāng)球孢白僵菌菌絲長(zhǎng)滿體表時(shí)，記錄時(shí)間、并用體視顯微鏡拍照。

1.2.5 家蠶生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 選取發(fā)育正常、體質(zhì)量相近的5 齡第2 天的家蠶，饑餓處理2 h 后進(jìn)行體質(zhì)量和體長(zhǎng)測(cè)量，記錄初始值。用微量注射器將5 μL 不同孢子懸液（濃度1×107個(gè)/mL）從背部注射家蠶。設(shè)置TST 菌株孢子懸液、BF 菌株孢子懸液、FDB 菌株孢子懸液和吐溫-80 無(wú)菌水（對(duì)照組）共4 組處理。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每組10 頭試蟲(chóng)。在直徑為9 cm 的無(wú)菌培養(yǎng)皿里正常飼養(yǎng)，每隔24 h 逐條進(jìn)行體質(zhì)量和體長(zhǎng)測(cè)量，計(jì)算每24 h 平均相對(duì)增長(zhǎng)量和72 h 的平均相對(duì)增長(zhǎng)量[28]。

1.2.6 TST 菌株對(duì)家蠶的毒力測(cè)定 將球孢白僵菌TST 菌株參照1.2.2 的方法配制成孢子懸液，最終濃度梯度為1×105、1×106、1×107個(gè)/mL，對(duì)照組（CK）為加有0.05%吐溫-80 的無(wú)菌水，注射劑量為5 μL。每處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 頭試蟲(chóng)。采用新鮮桑葉飼養(yǎng)，每隔24 h 進(jìn)行1 次觀察，記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算致死中濃度（LC50）和致死中時(shí)（LT50）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS13.0 軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足P＞0.05 再進(jìn)行方差分析和多重比較，并用GraphPad Prism 7 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶卵的致病力

從表1 可以看出，與對(duì)照組相比，各處理組孵化天數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），孵化天數(shù)基本保持在7 d 左右，這與正常家蠶無(wú)差別[29]。

表1 球孢白僵菌菌株侵染后卵的孵化天數(shù)

2.2 球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的致病力

從表2 可以看出，TST 和BF 菌株具有較高的致病力，對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率均超過(guò)50%，TST菌株的累計(jì)死亡率最高，達(dá)到了96.67%±5.77%。TST 菌株的LT50最短，為3.08 d，表明其對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的毒力最強(qiáng)；FDB 菌株的LT50最長(zhǎng)，為6.41 d，表明其對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的毒力最弱。綜上所述，TST 菌株對(duì)家蠶的致病力最強(qiáng)。

表2 球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的致病力

由表3 可知，TST 菌株的菌絲覆蓋家蠶表皮的時(shí)間為5.29 d，比FDB 和BF 菌株的時(shí)間更短，但這3 個(gè)菌株間沒(méi)有顯著差異。

表3 球孢白僵菌菌絲覆蓋家蠶表皮的時(shí)間

由圖1 可知，對(duì)照組家蠶體表形態(tài)正常，而TST、BF、FDB 菌株侵染后的家蠶體表與對(duì)照組相比，明顯被大量菌絲覆蓋、呈白色，家蠶體長(zhǎng)變短且僵直。

2.3 球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶幼蟲(chóng)體質(zhì)量變化的影響

由圖2 可知，對(duì)照組的增長(zhǎng)量比其他3 個(gè)處理組都快，且體質(zhì)量增加比較平穩(wěn)，沒(méi)有較大起伏；FDB 菌株處理的家蠶體質(zhì)量增長(zhǎng)量較對(duì)照稍慢，與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；BF 菌株處理的家蠶體質(zhì)量在后期（72 h）的增長(zhǎng)量與對(duì)照相比顯著減少（P＜0.001）；TST 菌株處理后家蠶的體質(zhì)量增量與對(duì)照相比差異極顯著，它的增長(zhǎng)量最少。所以，相比其他處理，TST 菌株對(duì)家蠶體質(zhì)量的影響最顯著，它能明顯抑制家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育。

從圖2 可以看出，4 個(gè)處理間72 h 平均相對(duì)增長(zhǎng)量有極顯著差異（P＜0.001）。BF 和TST 菌株處理家蠶后72 h，家蠶幼蟲(chóng)的體質(zhì)量增長(zhǎng)量顯著低于對(duì)照組和FDB 菌株處理組（P＜0.05），而FDB 菌株處理組與對(duì)照組間并沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶幼蟲(chóng)體長(zhǎng)變化的影響

球孢白僵菌侵染家蠶在一定程度上也會(huì)對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)造成影響，從圖3 可以看出，所有處理的家蠶幼蟲(chóng)體長(zhǎng)增長(zhǎng)量隨著感染時(shí)間的增加都有所減少。處理24 h 后，所有處理的家蠶體長(zhǎng)增長(zhǎng)量沒(méi)有明顯的規(guī)律，但是在48、72 h 對(duì)照組體長(zhǎng)增長(zhǎng)量比其他3 個(gè)處理組多，并且與TST 菌株處理間差異極顯著，說(shuō)明在3 種球孢白僵菌中TST 菌株的毒力最強(qiáng)，對(duì)家蠶幼蟲(chóng)體長(zhǎng)增長(zhǎng)的抑制作用最大。

由圖3 可知，4 個(gè)處理間72 h 平均相對(duì)增長(zhǎng)量有顯著差異（P＜0.01）。在BF 和TST菌株處理后72 h內(nèi)，家蠶幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而FDB 菌株處理與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 TST 菌株對(duì)家蠶的毒力測(cè)定

從表4 可以看出，TST 菌株的LC50為2.25×106個(gè)/mL[30]。孢子懸液的濃度越高，LT50越短，濃度為1×105、1×106、1×107個(gè)/mL 的球孢白僵菌侵染家蠶的LT50分別為6.20、5.12、3.36 d，表明孢子懸液的濃度越高，對(duì)家蠶的毒力越強(qiáng)。

表4 TST 菌株對(duì)家蠶的毒力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

有研究表明，綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾的卵有高達(dá)80%的致病力，而球孢白僵菌對(duì)其卵沒(méi)有顯著影響[31]。本研究中，3 株球孢白僵菌同樣對(duì)家蠶卵的孵化都無(wú)顯著影響，這可能是因?yàn)榧倚Q的卵殼厚而堅(jiān)硬，白僵菌的分生孢子難以入侵；當(dāng)卵孵化后，卵殼表面黏附的分生孢子可能會(huì)再次侵染幼蟲(chóng)，甚至造成多代傳播。球孢白僵菌對(duì)蟲(chóng)卵的致病力小，因此，在利用白僵菌生物防治時(shí)要選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)期。

致死中時(shí)（LT50）是目前高毒力菌株篩選的主要指標(biāo)[32-33]。目標(biāo)昆蟲(chóng)的累計(jì)死亡率越高，LT50越短，表明其有更強(qiáng)的致病力[34]。本研究中，球孢白僵菌對(duì)家蠶幼蟲(chóng)有明顯的致病力，TST 菌株毒力最強(qiáng)，對(duì)家蠶的累計(jì)死亡率可達(dá)96.67%，致死中時(shí)為3.08 d，其菌絲覆蓋表皮的時(shí)間為5.29 d，表明其具有開(kāi)發(fā)成生物防治劑的潛力。

本研究表明，對(duì)照組形態(tài)正常，而其他3 組球孢白僵菌侵染的家蠶體表都長(zhǎng)滿了白色的菌絲，但菌絲的顏色、生長(zhǎng)密度稍有差異，可能是因?yàn)檫@3 種白僵菌的特性和致病力強(qiáng)弱不同。并且白僵菌侵染的家蠶死亡后蟲(chóng)體大小比對(duì)照組要小很多，這也與前人的研究結(jié)果一致[19]。在本研究中，白僵菌侵染的初期，家蠶背部注射菌液的部位就開(kāi)始出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，幼蟲(chóng)活動(dòng)能力減弱，待家蠶死亡后，侵染部位的黑色斑點(diǎn)變大，體表其他部分也出現(xiàn)了大小不一的黑斑，稱為入侵斑[35]，之后菌絲首先從侵染部位長(zhǎng)出，在培養(yǎng)皿中潮濕培養(yǎng)后口器、節(jié)間膜被菌絲覆蓋，最后長(zhǎng)滿全身。

球孢白僵菌注射家蠶，家蠶幼蟲(chóng)的體質(zhì)量增長(zhǎng)量明顯低于對(duì)照組，并且TST 菌株在72 h 內(nèi)顯著抑制其體質(zhì)量的增長(zhǎng)。在處理后24 h 體長(zhǎng)增長(zhǎng)量沒(méi)有明顯的規(guī)律，這可能是由于球孢白僵菌處理的家蠶幼蟲(chóng)在前期取食桑葉的量較多，可提供更多的營(yíng)養(yǎng)和能量去應(yīng)對(duì)球孢白僵菌的攻擊；后期TST 菌株感染的家蠶體長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著減少，可能是由于球孢白僵菌在寄主體內(nèi)大量繁殖，致使?fàn)I養(yǎng)大量消耗，機(jī)體抵抗力降低。通過(guò)研究球孢白僵菌對(duì)家蠶體質(zhì)量體長(zhǎng)的影響，印證了球孢白僵菌侵染能引起昆蟲(chóng)取食量減少[36]，在一定程度上能夠?qū)η蜴甙捉┚诹謽I(yè)病蟲(chóng)害防治中具有指導(dǎo)意義。

GARCíA 等[37]報(bào)道了濃度為1.0×109個(gè)/mL 的球孢白僵菌菌株Bb42 侵染鱗翅目昆蟲(chóng)草地貪夜蛾2 齡幼蟲(chóng)的LT50為3.6 d，死亡率為96.6%。而本研究1×107個(gè)/mL 的球孢白僵菌菌株TST 對(duì)家蠶的LT50僅需3.36 d，相比之下，較前者的致死速度快，其對(duì)家蠶的累計(jì)死亡率高達(dá)96.67%。因此，TST 菌株致病力更強(qiáng)，未來(lái)在農(nóng)林害蟲(chóng)的生物防治方面具有更高的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)背部注射的方式初步探索了3 種球孢白僵菌菌株對(duì)家蠶的致病力，但球孢白僵菌感染家蠶的方式還包括體表侵染和口服等，對(duì)于不同侵染方式對(duì)家蠶的毒理數(shù)據(jù)仍需進(jìn)一步研究。此外，對(duì)球孢白僵菌致病機(jī)理的研究還需深入到細(xì)胞免疫和體液免疫[38]，這樣才能更加準(zhǔn)確地解釋球孢白僵菌與昆蟲(chóng)的互作機(jī)制。