王志龍，周雅莉，鄧咪咪，郝月茹，薛應紅，薛金愛，苑麗霞，李潤植

（1.山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801；2.晉中學院生物科學與技術學院，山西晉中030600）

亞麻薺（Camelina sativa（L.）Crantz）是一種十字花科亞麻薺屬的油料作物，具有耐低溫、耐旱、栽培簡單且生育期短等特點，因此，其栽培和應用日益廣泛[1]。亞麻薺種子中含有多種對人體有益的不飽和脂肪酸，是一種新型的油料作物，亞麻薺種子含油量高達52%，含有油酸、亞油酸、亞麻酸等多種不飽和脂肪酸，其中，α- 亞麻酸的含量高達30%[2-4]。已有研究證明，α- 亞麻酸具有增強人體免疫力、調(diào)節(jié)血脂、降壓降糖、延緩衰老等功效[5-7]。此外，亞麻薺油還可作為航天航空等生物燃油使用，在生物新能源領域具有巨大的開發(fā)潛力[8-9]。迄今為止，亞麻薺種子中的脂肪酸合成代謝機制還尚未完全解析，因此，對亞麻薺油脂合成機制的深入研究具有一定的實踐意義和應用價值。

LEC1（Leafy Cotyledon1）是編碼CCAAT-Box結(jié)合因子（CAAT box-binding factors，CBF）HAP3（Heme-activated protein）的一個亞基，是胚發(fā)育的一個重要調(diào)控因子，可調(diào)控多個成熟特異性基因的表達，增加種子貯藏蛋白的積累[10-11]。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)，LEC1參與脂肪酸的合成調(diào)控。LEC1過量表達可以調(diào)控油脂合成通路中多個脂肪酸相關基因的表達，從而改變脂肪酸的成分和含量。在擬南芥中，過表達LEC1可導致TAG 含量的增加，增加種子含油量[12]。玉米ZmLEC1基因過表達使突變體的種子含油量增加了48%[13]，通過基因共表達分析表明，ZmLEC1直接或間接調(diào)節(jié)ZmWRI1的表達。TAN 等[14]在油菜種子中特異表達BnLEC1，使轉(zhuǎn)基因油菜種子含油率提高2%～20%，且對主要農(nóng)藝性狀無負調(diào)控作用。異位表達LEC1同樣可調(diào)節(jié)與激素響應相關和光響應相關基因的表達[15]。可見，LEC1在植物的油脂合成過程中發(fā)揮著重要作用，然而，在亞麻薺中還未見LEC1轉(zhuǎn)錄因子的相關報道。

基于已經(jīng)公布的亞麻薺基因組數(shù)據(jù)[16]和已知功能的擬南芥AtLEC1 同源蛋白序列[12]，本研究通過對亞麻薺CsLEC1基因家族的鑒定、蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進化分析以及CsLEC1基因在種子不同發(fā)育時期的表達模式分析，旨在揭示CsLEC1 蛋白結(jié)構(gòu)和功能，為闡明亞麻薺CsLEC1基因?qū)ΨN子中油脂的合成調(diào)控機制和優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。

近日，中共漳州市委、漳州市人民政府印發(fā)《關于加強和完善城鄉(xiāng)社區(qū)治理的實施意見》（漳委發(fā)〔2018〕15號），明確漳州市將降低門檻，鼓勵家庭服務性質(zhì)的創(chuàng)業(yè)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站試驗田正常生長的亞麻薺種子為材料，采集開花后10、20、30、40 d 的亞麻薺種子，用液氮冷凍后于-80 ℃下貯存。

1.2 亞麻薺LEC1 基因家族成員鑒定

利用ProtParam 對亞麻薺CsLEC1編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果如表3 所示，CsLEC1的開放閱讀框為720～726 bp，編碼239～241 個氨基酸，分子質(zhì)量為25.89～26.10ku；CsLEC1-1 和CsLEC1-3為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＜40），CsLEC1-2 為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）；理論等電點小于7，均為酸性蛋白；親水性指數(shù)為負值，均為親水性蛋白。3 個CsLEC1 蛋白均無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽存在，且定位于細胞核，據(jù)此推測均屬非分泌型蛋白。

采用同源建模對三級結(jié)構(gòu)進行預測，以擬南芥組蛋白折疊二聚體“L1L NF-YC3”的晶體結(jié)構(gòu)（5g49.1 蛋白）[20]為模板，對CsLEC1 蛋白進行同源建模，結(jié)果如圖2 所示，亞麻薺3 個CsLEC1 蛋白與該模板蛋白的序列相似性和覆蓋率均為58%和38%，且3 個蛋白均以單體形式發(fā)揮作用。在亞麻薺CsLEC1 蛋白三級結(jié)構(gòu)內(nèi)可見3 個α 螺旋和2 個環(huán)結(jié)構(gòu)，三維模型一樣，說明該家族基因功能可能高度一致。

1.3 CsLEC1 基因編碼蛋白理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用Expasy 工具ProtParam（http://www.expasy.org/tools）分析CsLEC1編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析CsLEC1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測CsLEC1 蛋白的信號肽；使用WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）預測CsLEC1 蛋白的亞細胞定位。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html） 預測二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測三級結(jié)構(gòu)。

1.4 CsLEC1 蛋白多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

多序列比對結(jié)果如圖1 所示，亞麻薺CsLEC1氨基酸序列中均含有3 個α 螺旋（藍色橫線標注）和2 個L 環(huán)（紅色橫線標注），4 個LEC1 蛋白中均含有HAP3 亞基中高度保守的B 結(jié)構(gòu)域（灰色區(qū)域標出）。其中，α1 螺旋中存在DNA 結(jié)合序列“MPIANVI”，可以與CCAAT 結(jié)合因子相互作用；α2螺旋中存在亞基間相互作用的序列“IQECVSECISFI”[17-18]。在L1 組蛋白折疊基序和α2 螺旋結(jié)構(gòu)之間還存在1 個天冬氨酸Asp 殘基（紅色區(qū)域標出），該氨基酸殘基被證明是LEC1 蛋白中B 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重要功能位點，參與調(diào)控種子胚胎的形成[19]。

表1 其他物種的LEC1 蛋白基本信息

1.5 CsLEC1 基因在種子中的表達量分析

耳聾篩查在正常聽力育齡婦女中可有效檢出大量潛在的耳聾攜帶者，可以有效地避免耳聾患兒的出生，對于預防藥物性耳聾也是很有效的檢出手段。隨著耳聾出生缺陷預防工程在臨床的鋪展，一些檢測或者遺傳咨詢過程中遇到的問題也在增多，如檢測假陽性、表型-基因型差異性問題，對于檢測人員及遺傳咨詢醫(yī)生都需要不斷完善自我。

對獲得的3 個CsLEC1基因，利用Primer 6.0 軟件設計PCR 引物，引物信息如表2 所示。使用艾德萊公司的EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取亞麻薺種子的RNA，使用ABM 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 的第1 鏈用于后續(xù)試驗。以亞麻薺CsActin基因為內(nèi)參，用Genstar 公司的2×增強型染料實時熒光定量PCR 預混液進行qRT-PCR 試驗，反應體系為：正向和反向引物各0.2 μL、cDNA模板0.5 μL、2×RealStar Green Power Mixture 5 μL、RNase-free H2O 4.1 μL，共10 μL。采用3 步法熒光定量反應程序：95 ℃10 min；95 ℃15 s，59.9 ℃1 min，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt計算相對表達量。每個樣品進行3 次生物學重復。

表2 試驗所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻薺CsLEC1 編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

本試驗用擬南芥AtLEC1 蛋白序列（＞NP_173616.2）為檢索序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.camelinadb.ca/）中BLAST 分析，獲得亞麻薺CsLEC1基因序列，鑒定獲得3 個亞麻薺CsLEC1基因，分別命名為CsLEC1-1（Csa03g-025850.1）、CsLEC1-2（Csa14g027200.1）、CsLEC1-3（Csa17g028800.1）。

二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果如表4 所示，亞麻薺CsLEC1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈4 種結(jié)構(gòu)組成，且4 種結(jié)構(gòu)中，α 螺旋與無規(guī)則卷曲所占的比例最大。

表3 CsLEC1 蛋白的基本理化性質(zhì)

2.2 CsLEC1 氨基酸多序列比對

使用Genedoc 軟件對CsLEC1 和擬南芥AtLEC1 進行氨基酸多序列比對。用MEGA 7.0 中鄰接法構(gòu)建CsLEC1 蛋白和其他物種LEC1 蛋白（表1）的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3 CsLEC1 蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

②錨桿布置：錨桿排距1.0 m，每排13根。拱基線位置每側(cè)各打設一根，拱基線往下各布置5根錨桿，間距0.9 m。

根據(jù)上述分析，產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新速度對創(chuàng)新效益的影響可能存在非線性關系，即門檻效應。以單門檻為例，如果存在1個創(chuàng)新速度門檻水平τ，當S≤τ以及S＞τ時，產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新速度對創(chuàng)新效益的彈性系數(shù)并不一致，并呈現(xiàn)出顯著的差異，為此引入虛擬變量Di:

表4 CsLEC1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析 %

長期以來，我國的傳統(tǒng)金融業(yè)無法滿足居民的投資需求。股票市場波動較大風險高，銀行存款收益率低，收益率和風險無法同時滿足投資者的需求。個人理財產(chǎn)品的出現(xiàn)很好的解決了這一矛盾，雖然存在一定風險，但是相比于股市，個人理財產(chǎn)品的風險要小很多，與此同時個人理財產(chǎn)品的收益有遠遠高于銀行的固定存款。因此在很大程度上滿足了市場上大部分風險厭惡型的投資者。

2.4 CsLEC1 蛋白與其他物種LEC1 蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA 7.0 構(gòu)建進化樹如圖3 所示，LEC1 同源蛋白分為2 個亞族，即亞麻薺CsLEC1蛋白與擬南芥AtLEC1 蛋白、甘藍型油菜BnLEC1蛋白聚為一族，分析發(fā)現(xiàn)，這3 種植物均屬于十字花科植物，可能其有共同的進化來源和發(fā)揮相同的功能。該結(jié)果為后續(xù)解析亞麻薺CsLEC1基因的功能提供了重要的參考信息。

2.5 CsLEC1 基因的表達模式分析

通過對亞麻薺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]分析得知，CsLEC1基因僅在種子中有轉(zhuǎn)錄表達，亞麻薺種子是油脂的主要儲存器官，為探究亞麻薺CsLEC1基因在不同發(fā)育時期種子中的表達情況，以亞麻薺CsActin作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR 分析亞麻薺不同發(fā)育時期種子中CsLEC1基因的表達模式，結(jié)果如圖4 所示，在開花后10 ～20 d 的種子中，亞麻薺3 個CsLEC1基因表達量均逐漸升高，且在開花后20 d 表達量達到最大；隨著種子的發(fā)育成熟，3 個基因表達量逐漸降低。

3 結(jié)論與討論

本研究以擬南芥AtLEC1 蛋白序列為同源序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST 得到3 個CsLEC1 蛋白編碼基因，分別命名為CsLEC1-1、CsLEC1-2和CsLEC1-3。經(jīng)過理化性質(zhì)分析表明，亞麻薺CsLEC1 蛋白定位于細胞核中，為不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽的酸性、親水性蛋白，與擬南芥AtLEC1 的氨基酸理化性質(zhì)相似。蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，亞麻薺CsLEC1 蛋白中含有3 個α 螺旋結(jié)構(gòu)和2 個環(huán)結(jié)構(gòu)，為HAP3 高度保守的B 結(jié)構(gòu)域，證明這3 個CsLEC1 蛋白都屬于LEC1 家族。HAP3 亞基由A、B、C 共3 個結(jié)構(gòu)域組成[19]，其中，B 結(jié)構(gòu)域中具有5 個組蛋白折疊基序，3 個α 螺旋（α1、α2、α3）和2 個環(huán)結(jié)構(gòu)（L1、L2），α1 螺旋中存在DNA 結(jié)合序列MPIANVI，可與CCAAT 結(jié)合因子相互作用；α2 螺旋中存在亞基間相互作用的序列IQECVSECISFI[17-18]。CsLEC1 蛋白中α1 螺旋結(jié)構(gòu)中存在DNA 結(jié)合序列（MPIANVI），證明CsLEC1 可以起到轉(zhuǎn)錄激活作用。LEE 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥AtLEC1 的氨基酸序列中第55 位是天冬氨酸，該殘基被證明是LEC1蛋白中B 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重要功能位點，參與調(diào)控種子胚胎發(fā)育過程。從多序列比對結(jié)果可以看出，亞麻薺CsLEC1 在對應位置也存在天冬氨酸殘基，推測這3 個CsLEC1 蛋白具有與擬南芥AtLEC1 蛋白有相似的功能。亞麻薺CsLEC1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均與擬南芥AtLEC1 蛋白相似，三級結(jié)構(gòu)中還可以明顯地看到與多序列比對結(jié)果相同的5 個組蛋白折疊基序。系統(tǒng)進化樹表明，亞麻薺CsLEC1與擬南芥AtLEC2、甘藍型油菜BnLEC1 同源性較高，可能其具有相同的功能。

LOTAN 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtLEC1基因在種子中特異表達。文冠果XsLEC1基因在文冠果的根、莖、葉及花中均無表達，在種子中具有較高的表達，且是在種胚發(fā)育的前期表達量最高[23]。本研究表明，實時熒光定量結(jié)果顯示，亞麻薺CsLEC1在開花后10～20 d 的種子中高表達，在開花后20 d的表達量達到最高；隨著種子發(fā)育成熟，CsLEC1表達量呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，至種子發(fā)育晚期停止表達。因此，推測CsLEC1基因參與了亞麻薺種子的生長發(fā)育過程。研究表明，擬南芥中過表達LEC1可以激活油脂相關轉(zhuǎn)錄因子FUS3、ABI3、WRI1的表達[12]。為此，推測該基因在種子發(fā)育早期過程中參與了種子油脂的合成，在CsLEC1高表達的同時激活了下游基因的表達，并參與種子油脂的合成。在擬南芥中，過表達LEC1基因可以使TAG 的含量增加，同時也會上調(diào)FAD2基因的表達量[24]。FAD2可以將油酸合成亞油酸，是亞油酸合成的關鍵酶[25]。而亞油酸是合成α- 亞麻酸的重要底物，因此，通過對CsLEC1基因的深入研究將有助于提高亞麻薺中α- 亞麻酸的含量。

本研究鑒定得到3 個CsLEC1基因，編碼蛋白均含有“α1-L1-Asp-α2-L2-α3”結(jié)構(gòu)域，為HAP3亞基的B 結(jié)構(gòu)域，Asp 是LEC1 的功能位點；在開花后20 d 的種子中表達量最高。說明CsLEC1基因可能參與調(diào)控胚胎發(fā)育，而其與脂肪酸成分和含量的相關性以及油脂合成通路中的具體調(diào)控機制還有待進一步探究。