裴 婷，孔佳美，白培鈿，楊逢清，李 濤，張瑞杰，任玉紅

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素被作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于疾病防治、營養(yǎng)水平提升、養(yǎng)殖改善等各個方面[1]，但是由于經(jīng)濟(jì)效益的驅(qū)使和監(jiān)督管理不嚴(yán)，出現(xiàn)了抗生素、喹乙醇、喹諾酮等藥物的濫用，造成大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使得藥物療效大大降低甚至沒有效果，這些藥物也會在畜禽產(chǎn)品中大量殘留，會直接影響食品安全和危害人類健康，因此，無抗養(yǎng)殖的呼聲越來越高[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2017 年6 月發(fā)布《全國遏制動物源細(xì)菌耐藥行動計劃（2017—2020 年）》的通知，要求我國于2020 年起全面禁止人獸共用抗菌藥物或易產(chǎn)生交叉耐藥性的抗菌藥物作為動物促生長劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)中[3]。找到抗生素替代品、控制抗生素的使用量成為當(dāng)前要解決的重要課題。酶制劑[4]、益生菌[5]、復(fù)方中草藥[6]等抗生素替代品在養(yǎng)殖場的應(yīng)用，已成為禽畜養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢。大量試驗表明，酶制劑具有降解抗?fàn)I養(yǎng)因子、補充內(nèi)源酶、解離金屬元素、增強機體免疫力等作用[7]；益生菌則能夠調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力等功能[8]。二者聯(lián)合使用時能夠進(jìn)一步改善動物機體健康，提高飼料利用率，從而達(dá)到更加理想的生產(chǎn)應(yīng)用效果[9]。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道上皮細(xì)胞相互作用、相互影響，保護(hù)小腸不受細(xì)菌、病毒等微生物的侵襲和侵害，防止小腸對外來有害物質(zhì)的吸收，起到機體第一道防線的作用[10]。腸道MUC2 是構(gòu)成腸道黏液層的主要成分，主要是由杯狀細(xì)胞分泌的高分子糖蛋白，在組織和血液中還有細(xì)胞粘附、參與淋巴細(xì)胞循環(huán)、參與細(xì)胞間通訊和信息傳遞、維持細(xì)胞的極性、參與抗原呈遞和淋巴細(xì)胞活化作用等[11-12]。檢測腸道黏膜MUC2 的表達(dá)量能評估機體的腸道黏膜免疫功能。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實驗室科研團(tuán)隊自主研發(fā)的酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑由中性蛋白酶、纖維素酶、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌、嗜酸乳桿菌組成。本試驗通過對小鼠灌胃不同劑量的復(fù)合組劑，觀察試驗小鼠的生長性能，了解酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對小鼠生長狀況的影響；測定血液指標(biāo)，評估酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對小鼠健康狀況的影響；采用免疫組化和熒光定量PCR 法測定小鼠空腸和回腸黏膜MUC2 表達(dá)量和表達(dá)水平，了解復(fù)合組劑對腸道黏膜免疫的影響，為酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

BALB/C 小鼠，購自太谷青牧養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（晉）2019—0005。酶與微生態(tài)制劑的復(fù)合組劑由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院實驗室自行研制（未申請專利）。

MRS 固體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基（索萊寶）；Trizol（美國life）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（TAKARA），MUC2 抗體（武漢三鷹）；免疫組化試劑盒（康為世紀(jì)）等。

1.2 設(shè)備

Chemray 800 全自動生化分析儀為深圳雷杜生命科技產(chǎn)品；BC-2800vet 全自動血液細(xì)胞分析儀為邁瑞產(chǎn)品；石蠟切片機、石蠟包埋機、攤片機、顯微鏡為德國Leica 公司產(chǎn)品；定量PCR 檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養(yǎng) 選取48 只的28 日齡BALB/C 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為（16±2）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按照隨機分組原則分為4 組，每組雌雄各6 只，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。對照組灌胃0.2 mL 無菌蒸餾水，低、中、高劑量組分別以2.5、5、10 g/kg 灌胃酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑持續(xù)灌胃28 d。試驗期間同室分籠喂養(yǎng)，自由采光和飲水。

1.3.2 生長性能測定 試驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、被毛光澤度情況，每隔7 d 對小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量并記錄。

1.3.3 血液指標(biāo)檢測 28 d 后禁食12 h，摘取小鼠眼球采血，部分置于EDTA 抗凝管內(nèi)收集全血，用于血液生理指標(biāo)檢測；部分置于非抗凝采血管內(nèi)，血液靜置2 h 或4 ℃過夜，凝結(jié)后以3 000 r/min 離心10 min，取血清，放置-80 ℃保存，用于全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血尿素氮和肌酐含量。

1.3.4 免疫組化檢測MUC2 含量 28 d 后禁食12 h，頸椎脫臼處死小鼠，進(jìn)行解剖檢查，取空腸、回腸組織固定于4%的多聚甲醛溶液中，沖水，脫水，石蠟包埋，切片。組織切片進(jìn)行脫蠟，并用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行高溫修復(fù)，應(yīng)用免疫組化試劑盒進(jìn)行一抗和二抗的孵育，DAB 顯色，蘇木精染色，0.1%鹽酸酒精分化，自來水和0.1%氨水返藍(lán)，組織切片進(jìn)行梯度酒精脫水，封片。用光學(xué)顯微鏡觀察，是否出現(xiàn)棕黃色顆粒，有棕黃色顆粒為陽性。并隨機選取5 個視野，通過Image J18.0 軟件進(jìn)行圖像分析MUC2 含量。

1.3.5 腸道黏膜MUC2 mRNA 相對表達(dá)量的測定將小鼠的空腸和回腸組織用液氮處理，用trizol 法進(jìn)行總RNA 的提取。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA 的反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。根據(jù)NCBI 上基因數(shù)據(jù)庫查找目的基因MUC2 以及內(nèi)參GAPDH 相對應(yīng)的基因序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計各基因的上下游引物（表1）。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用單因素分析進(jìn)行統(tǒng)計分析及顯著性檢驗。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對小鼠生長性能的影響

小鼠灌胃酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑后精神狀態(tài)無異常，生長狀況良好，呼吸正常，體質(zhì)量增加，被毛有光澤。用不同劑量的復(fù)合組劑灌胃小鼠后，體質(zhì)量變化如表2 所示。從表2 可以看出，小鼠在灌胃不同劑量的酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑后，7、14 d，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加，但無顯著差異性（P＞0.05）；在21 d，中劑量組和高劑量組的小鼠體質(zhì)量增加明顯，差異顯著（P＜0.05），低劑量組的小鼠體質(zhì)量無顯著差異性（P＞0.05）；28 d 時，各試驗組的小鼠體質(zhì)量明顯增加，差異性顯著（P＜0.05）。

表2 各組小鼠體質(zhì)量結(jié)果比較 g

2.2 酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對小鼠血液指標(biāo)的影響

由表3 可知，試驗組和對照組的血常規(guī)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。其中，灌胃中劑量和高劑量的試驗組小鼠白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)均比對照組高，且差異顯著（P＜0.05）。由表4 可知，試驗組和對照組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血尿素氮和肌酐的生化檢查結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，且無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組小鼠血常規(guī)結(jié)果比較

表4 各組小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果比較

2.3 酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對腸黏膜MUC2 表達(dá)水平的影響

免疫組化結(jié)果如圖1、2 所示，對照組和各試驗組空腸和回腸黏膜表面均有MUC2 的表達(dá)，與對照組相比，各試驗組腸道黏膜表面MUC2 的表達(dá)量增高。通過Image J18.0 軟件進(jìn)行圖像分析MUC2 含量，結(jié)果如圖3、4 所示，與對照組相比，灌胃低劑量復(fù)合組劑的空腸黏膜表面MUC2 表達(dá)量增加，且差異顯著（P＜0.05），低劑量復(fù)合組劑的回腸黏膜表面MUC2 表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05）；灌胃中劑量復(fù)合組劑小鼠的空腸和回腸黏膜表面MUC2 表達(dá)量增加，且差異均極顯著（P＜0.01）；灌胃高劑量復(fù)合組劑小鼠的空腸和回腸黏膜MUC2 表達(dá)量增加，且差異均顯著（P＜0.05）。

2.4 酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對腸黏膜MUC2 mRNA 表達(dá)水平的影響

熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖5、6），灌胃酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑小鼠的腸道黏膜MUC2 mRNA表達(dá)水平不同程度高于對照組。與對照組相比，低劑量組小鼠空腸和回腸的MUC2 mRNA 表達(dá)水平增加，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；中劑量組空腸和回腸MUC2 mRNA 表達(dá)水平增加，差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；高劑量組小鼠空腸MUC2 mRNA 表達(dá)水平增加，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），回腸mRNA 表達(dá)水平增加，差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

近年來，人們對替代抗生素產(chǎn)品的研究日益深入，酶制劑和微生態(tài)制劑的應(yīng)用逐漸成為發(fā)展趨勢，也日益受到重視。本研究表明，酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑作為新型飼料添加劑對小鼠生長具有促進(jìn)作用，這是由于復(fù)合組劑是由益生菌和酶制劑復(fù)合而成。益生菌能夠增加動物小腸的黏膜皺裂，增加絨毛長度，加深陷窩深度，使小腸吸收面積增大，促進(jìn)營養(yǎng)的吸收，也能夠提供動物生長發(fā)育所必需的部分營養(yǎng)物質(zhì)、酶及調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)動物生長[13-14]。酶制劑能消除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子或有害物質(zhì)，提高飼料的營養(yǎng)，同時能補充內(nèi)源性消化酶的不足，促進(jìn)消化吸收[15-16]。兩者共同作用可以促進(jìn)飼料在小鼠體內(nèi)的消化與吸收，促進(jìn)小鼠生長，提高其生長性能。

血常規(guī)和血清生化指標(biāo)檢查可以反映動物機體的健康水平，用于評估機體的健康狀況[17-20]。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是參與氨基酸代謝的酶，是肝臟功能損傷最敏感的檢測指標(biāo)，它常出現(xiàn)于形態(tài)學(xué)發(fā)生變化之前[21]。肌酐、血尿素氮是判定腎臟是否損傷的重要指標(biāo)，可判斷腎功能是否正常[22]。本試驗表明，小鼠灌胃28 d 后，各組小鼠的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，表明酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑不會引起小鼠肝腎功能損傷。白細(xì)胞不僅參與機體的非特異性免疫，還參與機體的特異性免疫，具有強大的吞噬能力和免疫功能[23-24]。血液中淋巴細(xì)胞是由淋巴結(jié)、脾臟等淋巴組織釋放而來，具有保護(hù)機體的作用。田其真等[25]給健康犬連續(xù)口服28 d 唾液乳酸桿菌TCSL1 后，犬的淋巴細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)顯著增加，白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量相對升高，表明口服唾液乳酸桿菌TCSL1 能增強犬的免疫功能。本試驗表明，中劑量組的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于低劑量組和高劑量組，高劑量組比低劑量組的值略高，說明酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑具有增強免疫和抵抗感染的作用。

MUC2 可在腸道的表面形成一層黏液層，起到潤滑和拮抗致病菌的腸道粘附和侵襲的作用[26]。微生物及其代謝產(chǎn)物可以影響MUC2 的合成與分泌，調(diào)節(jié)MUC2 的生成，如牙雙歧桿菌可通過刺激杯狀細(xì)胞自噬來調(diào)節(jié)黏液的合成并上調(diào)MUC2 黏蛋白的分泌[27]。ROKANA 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以與腸細(xì)胞表面的Toll 樣受體4（TLR4）結(jié)合，通過MyD88 途徑刺激NF-κB，從而上調(diào)MUC2 黏蛋白的表達(dá)。本試驗表明，不同劑量的復(fù)合組劑均能增加空腸和回腸中MUC2 含量，提示酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑能通過增加MUC2 蛋白含量來加強腸道的黏液屏障，提高機體對致病菌的防御作用。

黏液蛋白的合成和分泌依賴于其mRNA 的表達(dá)，本試驗應(yīng)用熒光定量PCR 對不同處理的小鼠空腸和回腸段MUC2 的mRNA 的相對表達(dá)量進(jìn)行了評價。本試驗結(jié)果表明，試驗組中空腸和回腸內(nèi)MUC2 mRNA 的表達(dá)量比對照組高，且中劑量組的表達(dá)量最高，這與免疫組織化學(xué)法檢測的空腸和回腸內(nèi)蛋白含量結(jié)果基本一致，揭示酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑能夠提高腸道內(nèi)MUC2 mRNA 的表達(dá)，并且促進(jìn)黏蛋白MUC2 的合成和分泌。

綜上所述，酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑對實驗小鼠的生長具有促進(jìn)作用；能提高血液中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增加機體的抵抗力；能夠增加腸道MUC2 的含量和mRNA 表達(dá)量，增強腸道屏障功能，可為酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。