陳 健 ,陳奀飛 ,王 莉 ,盛 力 ,沈大冬 ,韓忠耀

(1.浙江醫(yī)藥股份有限公司研究院,紹興 312500;2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,都勻 558000)

磷酸吡哆醛(PLP)是維生素B6(VB6)的主要輔酶活性形式,參與多種氨基酸代謝轉(zhuǎn)化[1-2],其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。其中,涉及氨基酸多種反應(yīng),在代謝轉(zhuǎn)換、物質(zhì)合成中發(fā)揮著極為重要的作用[3]。PLP 既可以作為藥物用于臨床,促進(jìn)轉(zhuǎn)氨作用提高體內(nèi)多巴胺的含量[4],進(jìn)而用于治療帕金森綜合征[5];也可以作為其他原料藥的起始物料,用于合成β-羰基酰胺類(lèi)藥物等研究[6]。

圖1 PLP的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of PLP

PLP一般以VB6為原料合成[7-8],因此,在PLP質(zhì)量研究中,VB6(已知雜質(zhì))和其有關(guān)物質(zhì)(未知雜質(zhì))的含量測(cè)定具有十分重要的意義。長(zhǎng)久以來(lái),起始物料的質(zhì)量控制在原料藥注冊(cè)技術(shù)要求中一直有著舉足輕重的地位,人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)及各國(guó)藥審監(jiān)督機(jī)構(gòu)相繼出臺(tái)相關(guān)技術(shù)要求予以規(guī)范。目前,對(duì)于PLP 的研究,主要以合成工藝改進(jìn)、生物代謝轉(zhuǎn)化[9-10]及臨床治療[11-12]居多,對(duì)于其質(zhì)量控制的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本工作應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)建立了PLP中VB6及其有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定的方法,為PLP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立,提供更為科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)和方法參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配紫外檢測(cè)器(VWD)、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和Agilent Open Lab CDS2.3色譜工作站;XS205型分析天平;S220型pH 計(jì)。

磷酸二氫鉀-1-庚烷磺酸鈉緩沖溶液:稱(chēng)取0.85 g磷酸二氫鉀和3.0 g 1-庚烷磺酸鈉,溶于1 L水中,并用三氟乙酸調(diào)節(jié)溶液pH 至3.0。

稀釋劑:稱(chēng)取磷酸氫二鉀4.33 g溶于1 L水中,作為試驗(yàn)中配制溶液的稀釋劑備用。

PLP對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:2.50 g·L-1,稱(chēng)取PLP對(duì)照品50.0 mg于20 mL容量瓶中,用稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

VB6對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:62.5 mg·L-1,稱(chēng)取VB6對(duì)照品12.50 mg于200 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP對(duì)照品溶液:5.00 mg·L-1,稱(chēng)取PLP 對(duì)照品12.50 mg于25 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。移取該溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

VB6對(duì)照品溶液:2.52 mg·L-1,稱(chēng)取VB6對(duì)照品6.30 mg于25 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。移取該溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP供試品溶液:0.5 g·L-1,稱(chēng)取PLP 供試品約25 mg于50 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP 對(duì)照品(批號(hào):100855-200701,純度為99.3%),VB6對(duì)照品(批號(hào):100116-201705,純度為100.0%);PLP供試品(來(lái)自3家公司,批號(hào)分別為170803H、20191015、AR1930N01);磷酸二氫鉀(純度為99%),磷酸氫二鉀(ACS 級(jí)),1-庚烷磺酸鈉(純度為99.5%),三氟乙酸(純度為99.9%),乙腈(純度不小于99.9%);試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm;流量0.9 mL·min-1;柱溫47 ℃;進(jìn)樣量5μL;流動(dòng)相:A 為磷酸二氫鉀-1-庚烷磺酸鈉緩沖溶液,B為乙腈。梯度洗脫:初始A為100%,保持13 min;13～25 min時(shí),A 由100%降至80%,保持10 min。

1.3 試驗(yàn)方法

移取一定量的待測(cè)液(對(duì)照品溶液或供試品溶液),按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄目標(biāo)物峰面積。采用外標(biāo)法定量,以峰面積計(jì)算VB6含量,其他未知雜質(zhì)使用主成分對(duì)照法計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

分別移取PLP 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL 和VB6對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.4 mL,置于同一個(gè)10 mL容量瓶中,加稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。于色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,所得色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 PLP和VB6對(duì)照品混合溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the mixture solution of PLP and VB6reference

由圖2可見(jiàn):PLP 和VB6可以完全分離,相互之間無(wú)干擾,方法具有良好的專(zhuān)屬性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相、流量和柱溫

根據(jù)查閱文獻(xiàn)可知,可使用HPLC測(cè)定VB6的含量[13-15]。由于PLP 是一種非常重要的維生素B族化合物[16],且為極性較強(qiáng)的兩性化合物,因此使其和有關(guān)物質(zhì)均在色譜體系下得以合適的保留,成為方法建立的關(guān)鍵。在方法建立初期,本研究根據(jù)PLP的化合物結(jié)構(gòu)以及合成工藝中潛在雜質(zhì)分析,首先考察了流動(dòng)相分別為烷基磺酸鹽和四烷基銨鹽離子對(duì)試劑時(shí)對(duì)各組分分離的影響。結(jié)果顯示:VB6在四烷基銨鹽為流動(dòng)相的色譜體系下,難以保留。因此,試驗(yàn)選用烷基磺酸鹽中含碳鏈較長(zhǎng)的庚烷磺酸鈉鹽(1-庚烷磺酸鈉)作為流動(dòng)相A 相,同時(shí)用三氟乙酸和磷酸二氫鉀將pH 調(diào)節(jié)至酸性,使PLP和VB6中的氮原子均帶正電荷,與離子對(duì)試劑緊密結(jié)合,再通過(guò)柱溫以及流量的優(yōu)化調(diào)整,使PLP中的VB6以及其他雜質(zhì),均有良好的保留時(shí)間和較好的分離度,優(yōu)化后的色譜條件見(jiàn)1.2節(jié)。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

PLP和其他雜質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)為294 nm,VB6最大吸收波長(zhǎng)為292 nm,通常紫外波長(zhǎng)檢測(cè)允許誤差范圍為±2 nm,因此,結(jié)合PLP、VB6和其他雜質(zhì)的紫外吸收情況(圖3)及流動(dòng)相噪聲背景等,試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm,經(jīng)方法驗(yàn)證,在該波長(zhǎng)下檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)健性。

圖3 PLP和VB6紫外吸收全波長(zhǎng)光譜圖Fig.3 UV absorption full wavelength spectrograms of PLP and VB6

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

配制PLP和VB6對(duì)照品溶液系列,按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以PLP 和VB6的峰面積為縱坐標(biāo),兩者的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算PLP 和VB6檢出限(3S/N);以10倍信噪比計(jì)算PLP和VB6測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PLP和VB6的線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits,and lower limits of determination of PLP and VB6

2.4 方法的精密度

稱(chēng)取PLP供試品25 mg于50 mL 容量瓶中,向其中加入VB6對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,平行配制6份,按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示:6份供試品溶液中VB6的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.48%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.92%;其他未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.39%,1.71%,RSD 分別為2.8%,1.5%。

另一分析員,在不同日期使用不同儀器,重復(fù)平行配制上述溶液6份,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示:6份溶液中VB6的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.54%,RSD 為0.89%;其他未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.47%,1.82%,RSD 分別為2.5%,1.3%。表明在該色譜體系下,測(cè)定PLP 中的VB6含量及其有關(guān)物質(zhì)具有較好的重復(fù)性。

2.5 回收試驗(yàn)

稱(chēng)取9份PLP供試品25 mg于50 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,作為空白VB6供試品溶液。按照ICH Q2B[17]中范圍的要求,每3份空白供試品溶液作為一組,3組供試品分別在高、中、低3個(gè)水平的加標(biāo)量下加入VB6對(duì)照品,按色譜工作條件進(jìn)樣測(cè)定,每份重復(fù)測(cè)定5次,計(jì)算VB6的回收率和測(cè)定值的RSD,結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知:VB6的回收率為99.5%～102%,該方法可準(zhǔn)確定量PLP中VB6的含量。

2.6 方法的穩(wěn)健性

固定其他色譜條件,分別改變色譜條件中的流量和柱溫兩個(gè)條件,以考察方法的穩(wěn)健性。稱(chēng)取PLP供試品25 mg于50 mL容量瓶中,向其中加入VB6對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,平行配制6份,考察流量為0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1,柱溫為46 ℃和48 ℃時(shí),供試品中各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況,結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of test of recovery(n＝5)

表3 方法的穩(wěn)健性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for robustness of the method

由表3可知:流量和柱溫的小幅度變化,VB6、其他雜質(zhì)和總雜質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果基本一致。表明該方法具有良好的穩(wěn)健性。

2.7 樣品分析

取來(lái)自3個(gè)生產(chǎn)廠家的不同批號(hào)的PLP 供試品溶液、VB6對(duì)照品溶液和PLP 對(duì)照品溶液,按試驗(yàn)方法測(cè)定其中VB6及其他有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表4;VB6對(duì)照品溶液和其中批號(hào)為170803 H 的供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of samples %

圖4 VB6對(duì)照品溶液和PLP供試品溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of VB6reference solution and PLP sample solution

本工作建立的高效液相色譜檢測(cè)方法,可以更準(zhǔn)確地測(cè)定PLP 中VB6和其他未知雜質(zhì)的含量,且方法的靈敏度高、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng),可為PLP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。