王 穎，趙志武

（天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，天津 301900）

麻疹（measles）是一種由于麻疹病毒導(dǎo)致的急性呼吸道感染病，患者臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、咳嗽、結(jié)膜炎等[1]。近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏的加快以及飲食習(xí)慣的改變，麻疹的發(fā)病率逐年上升，且傳染性較強(qiáng)，因此有效地預(yù)防措施至關(guān)重要。麻疹與急疹、藥疹、風(fēng)疹等具有一定的相似性，臨床鑒別診斷的難度較大，如何選擇有效地診斷方式，是目前臨床面臨的重要課題之一[2]。目前臨床中檢測(cè)麻疹病毒的常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 等，前者是傳統(tǒng)臨床診斷麻疹病毒的方法，而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 則是近年來(lái)出現(xiàn)的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，不僅檢測(cè)速度較快，且具有高敏感度、高靈敏度的特性[3]。本研究對(duì)比了ELISA 法與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 法在麻疹病毒檢測(cè)中的應(yīng)用效果，旨在分析實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 在麻疹病毒檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年12 月～2020 年12 月天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心收治的65例疑似麻疹患者作為研究對(duì)象，其中男性38例，女性27例，年齡1～13 歲，平均年齡（7.28±1.36）歲?；颊吲R床癥狀均表現(xiàn)為不同程度的發(fā)熱、咳嗽、結(jié)膜炎等。

1.2 方法 所有患者均在出疹后7 d 內(nèi)抽取血液樣本、采集咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。抽取患者靜脈血2～3 ml，在4 ℃環(huán)境下離心處理，以2000 r/min 的速率持續(xù)離心10 min。離心結(jié)束后收集上層血液，在2℃～8 ℃環(huán)境下保存待測(cè)。

1.2.1 ELISA 法檢測(cè) 根據(jù)麻疹病毒IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司，產(chǎn)品注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械＜準(zhǔn)＞字2014 第3401262 號(hào)）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)束后空白調(diào)零，通過(guò)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）得出450 nm 處吸光度值，或通過(guò)A450-630 nm 計(jì)算吸光度值，分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè) 在患者出疹第5天采集咽拭子樣本，通過(guò)無(wú)菌棉簽蘸取咽部分泌物，蘸取時(shí)應(yīng)避開(kāi)口腔黏膜、舌等部位。置入添加3～5 ml病毒標(biāo)本保存于液內(nèi)，在標(biāo)本袋頂端折斷棉簽。之后提取RNA，進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。采用RT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒（江蘇碩世生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，合理配置反應(yīng)體系，在PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）中進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件如下：逆轉(zhuǎn)錄溫度控制在50 ℃，時(shí)間為15 min，循環(huán)1 次；預(yù)變性溫度控制在95 ℃，時(shí)間為15 min，循環(huán)1 次；退火、變性、延伸溫度控制在94 ℃，時(shí)間為15 s，循環(huán)40 次。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，收集所有熒光信號(hào)。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率及不同采樣時(shí)間陽(yáng)性檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 檢測(cè)陽(yáng)性率為29.23%（19/65），高于ELISA 法檢測(cè)陽(yáng)性率的10.77%（7/65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.923，P=0.009）。

2.2 不同檢測(cè)時(shí)間兩種方法陽(yáng)性率比較 第1 天，ELISA 法檢測(cè)陽(yáng)性率低于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第5 天，ELISA 法檢測(cè)陽(yáng)性率高于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余時(shí)間段兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)時(shí)間兩種方法陽(yáng)性率比較[n（%）]

3 討論

麻疹是國(guó)際范圍內(nèi)較常見(jiàn)的疾病類(lèi)型，患者得病后會(huì)有發(fā)熱、出疹等癥狀。該疾病多發(fā)生于2 歲以下的患者，發(fā)病率約為40%～50%，其次為20～39 歲的患者，發(fā)病率為25%～35%[4]。近年來(lái)，疫苗在臨床得到了廣泛的應(yīng)用，但同時(shí)隨著病毒毒性變化以及成年麻疹病毒感染的發(fā)生率的上升，導(dǎo)致麻疹患者受到病毒感染后無(wú)明顯癥狀，不僅延長(zhǎng)了診斷時(shí)間，也難以有效與風(fēng)疹等類(lèi)似疾病鑒別，大大提高了臨床診斷的難度[5]。麻疹在發(fā)病的前后5 d，具有較高的傳染性，易感患者與感染源接觸后，發(fā)病率極高[6]。因此，臨床一旦發(fā)現(xiàn)疑似麻疹患者，應(yīng)給與高度重視，及時(shí)進(jìn)行相關(guān)臨床檢測(cè)，提高檢出率，保證診斷的及時(shí)性與準(zhǔn)確性，從而避免麻疹的廣泛傳播[7]。

傳統(tǒng)臨床對(duì)麻疹患者進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)時(shí)，會(huì)提取患者的血液樣本或鼻咽部分泌物。當(dāng)麻疹患者出現(xiàn)皮疹時(shí)的第1 天即可檢測(cè)出麻疹病毒，因此臨床檢測(cè)對(duì)于早期麻疹的鑒別診斷中具有重要的作用。臨床檢測(cè)麻疹病毒的方式較多，其中ELISA 法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 法是目前最常見(jiàn)的類(lèi)型，和其他方法相比，這兩種方法的操作較為簡(jiǎn)單，且可實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，靈敏度高[8]。多項(xiàng)研究顯示[9-11]，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 相比ELISA 法對(duì)麻疹病毒的檢出率更高，可能是由于當(dāng)患者受到麻疹病毒感染后，特異性IgM 抗體反應(yīng)需要一定的時(shí)間，隨著采血時(shí)間的改變，診斷的結(jié)果也會(huì)發(fā)生一定的變化。若采血時(shí)間過(guò)早，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，若采血時(shí)間過(guò)遲，不僅會(huì)增加采血的難度，還可能錯(cuò)過(guò)最佳的治療窗口時(shí)間，影響臨床療效，對(duì)患者的早期診斷與治療造成了嚴(yán)重的影響。由此可以看出，ELISA 法在臨床麻疹病毒的檢測(cè)中存在明顯的缺陷。本次研究結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于ELISA 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。65例疑似麻疹患者均在出疹7 天內(nèi)采集樣本，ELISA 法出疹第1 天檢測(cè)陽(yáng)性率為14.29%；，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 出疹第1 天檢測(cè)陽(yáng)性率為73.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA 法出疹第5 天陽(yáng)性率為28.57%，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 法出疹第5 d 陽(yáng)性率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，不同的采血時(shí)間其檢出率也有所不同。在出疹后的1～3 d，ELISA 法檢出率較高，當(dāng)出疹時(shí)間延長(zhǎng)至4～7 d 時(shí)，ELISA 法檢出率有明顯的下降趨勢(shì)。因此，臨床對(duì)于疑似麻疹患者，應(yīng)在出疹后立即采集樣本，并通過(guò)ELISA 法檢測(cè)血清樣本IgM 體，若病毒檢測(cè)顯示特異性為陰性，則應(yīng)在出疹后4～28 d 內(nèi)再次檢測(cè)，從而有效控制疾病的傳播。實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 在麻疹病毒檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，陽(yáng)性率高于ELISA 法，且能夠在出疹后1 d 檢測(cè)出麻疹病毒，對(duì)早期診斷、治療具有重要的參考價(jià)值，還有利于控制疾病的傳播。

根據(jù)熒光定量RT-PCR 計(jì)數(shù)的特點(diǎn)，檢測(cè)方法可分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N。絕對(duì)定量指的是通過(guò)對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋?zhuān)鶕?jù)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)中ct 值與初始RNA 或eDNA 拷貝數(shù)有線(xiàn)性關(guān)系，醫(yī)務(wù)人員可以根據(jù)這種關(guān)系，通過(guò)分析CT 值明確未知樣品起始模板拷貝數(shù)[12]。使用這種方法時(shí)，首先需要架設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品的擴(kuò)增效率相等，在稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，要保證處于可測(cè)量的范圍內(nèi)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的選擇較為多樣化，既可以是雙鏈DNA，也可以是單鏈DNA 或承載靶序列的eRNA[13]。該測(cè)量方法主要用于體液中病毒或腫瘤負(fù)荷的定量。絕對(duì)定量法的檢測(cè)準(zhǔn)確度與標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度密切相關(guān)。但這種方法也存在一定的缺陷，即檢測(cè)時(shí)樣品中可能存在抑制劑，可能會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[14]。相對(duì)定量指的是在測(cè)量目的基因的同時(shí)，測(cè)量另一內(nèi)源性管家基因，先對(duì)目的RNA 的ct 值與管家基因ct 值進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)結(jié)果設(shè)置目的RNA 的值，實(shí)現(xiàn)各個(gè)樣品之間的互相對(duì)比，能夠分析出不同樣品RNA 的相對(duì)表達(dá)量[15]和絕對(duì)定量相比，相對(duì)定量法的關(guān)鍵在于保證RNA 與內(nèi)源性管家基因的擴(kuò)增效率相同，否則也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[16]。

在熒光定量RT-PCR 技術(shù)中，每個(gè)環(huán)節(jié)都至關(guān)重要，一旦出現(xiàn)人為失誤，就會(huì)對(duì)檢測(cè)的結(jié)果造成影響[17，18]。目前醫(yī)學(xué)界認(rèn)為Oligo（dT）是合成cDNA 的最佳選擇，特異性明顯高于其他隨機(jī)引物。該物質(zhì)僅會(huì)與帶有poly A+（多聚腺苷酸）尾巴的mRNA 結(jié)合，但是Oligo（dT）對(duì)RNA 序列的要求較高，不僅需要高質(zhì)量，還要保證是全長(zhǎng)，因此甲醛固定經(jīng)石蠟包埋組織中提取的片段RNA 難以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄[19]。另一方面，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中若出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)或引物探針結(jié)合點(diǎn)位處于mRNA 的5 端時(shí)可能會(huì)造成影響，因此臨床使用時(shí)可以將Oligo（dT）與隨機(jī)引物混合使用，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。最好的方法是選擇目標(biāo)特異性引物合成的cDNA 特異，這樣能得到較為精確的結(jié)果，但由于不同目標(biāo)的特異性RNA 逆轉(zhuǎn)錄需要單獨(dú)進(jìn)行，當(dāng)提取到的RNA 量較少時(shí)，會(huì)出現(xiàn)浪費(fèi)的情況[20]；第三，抑制劑影響。RNA 在提取、純化所經(jīng)歷的各個(gè)環(huán)節(jié)中，都存在著不同的抑制劑，會(huì)對(duì)mRNA 的定量造成一定的影響，例如體液成分、血紅蛋白、尿素等。另一方面，DNA 片段、殘余抗凝劑等也會(huì)對(duì)PCR 的發(fā)生效率造成影響，不同的多聚酶對(duì)不同抑制劑的敏感性也有所區(qū)別，導(dǎo)致PCR 結(jié)果存在一定的誤差。因此，在選擇材料時(shí)，應(yīng)以耐熱DNA 多聚酶為主。此外，還有一些其他因素可能影響RT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果，如實(shí)驗(yàn)室、操作人員、公司試劑等，臨床中必須要對(duì)這些因素進(jìn)行全面的質(zhì)量控制，保證RT-PCR 的檢測(cè)質(zhì)量。

綜上所述，對(duì)麻疹病毒采取實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 檢測(cè)，具較高的陽(yáng)性檢出率，降低麻疹漏診率，操作簡(jiǎn)單，為麻疹疫情早期控制及處理起到積極的促進(jìn)意義。