張 潔，楊 譚，盧永剛

（廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院藥劑科，廣西柳州545007）

癌癥是臨床上常見的惡性腫瘤，進展快、死亡率高，給患者身心及經(jīng)濟上帶來了巨大損害。腫瘤分子靶向藥物的出現(xiàn)將癌癥的治療推向了一個前所未有的階段。使用腫瘤分子靶向藥物治療腫瘤面臨的最主要問題就是耐藥，一些分子靶向藥物可能同時具有多種耐藥機制。靶向藥物耐藥的主要機制包括微環(huán)境的改變、基因突變、建立代償信號通路、存在腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤對靶向藥產(chǎn)生耐受性等。近年來，高通量功能性篩選技術(shù)為腫瘤研究提供了精準的基因?qū)W信息。而CRISPR?Cas9文庫篩選技術(shù)是一種精準、簡便、高效的基因編輯工具，為腫瘤相關(guān)耐藥基因的功能學研究提供了新方法、新思路［1］。本文總結(jié)了CRISPR?Cas9文庫篩選技術(shù)在腫瘤耐藥基因篩選中的研究進展。

1 耐藥基因篩選的現(xiàn)狀

篩選耐藥基因當前常用策略主要分為兩種，即功能缺失型篩選及功能獲得型篩選。RNA干擾（RNA interference，RNAi）在真核細胞中廣泛存在，已廣泛應用于功能性缺失基因的高通量篩選［2］。與cDNA文庫相比，RNAi文庫篩選雖具有簡單、高效、高通量的優(yōu)點，但仍存在一些問題［3］。無論是使用cDNA文庫還是RNAi文庫進行耐藥基因篩選都不夠精準。因此，尋找新的篩選工具對腫瘤耐藥基因的發(fā)現(xiàn)及研究有著重要的意義。

2 CRISPR?Cas9的生物學特性

CRISPR?Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中為了對抗入侵的病毒及外源DNA進化形成的一種適應性免疫防御［4］。CRISPR?Cas于1987年被首次發(fā)現(xiàn)，其強大的剪切編輯功能在2010年被研究清楚，從而被廣泛應用于生物學研究［5］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能識別出入侵者的原間隔序列并記錄到CRISPR序列中。當剪切基因時，crRNA首先被轉(zhuǎn)錄成pre?crRNA。特異性RNA核酸酶和活化的cas9對pre?crRNA進行加工［6］。CRISPR?Cas9系統(tǒng)通過與目標序列互補配對，引導Cas9定位于目標基因，在PAM上游約3 bp處進行DNA雙鏈切割［7］。當沒有修復模板時，將通過非同源末端連接將DS?Bs重新連接，這樣容易產(chǎn)生插入或突變?nèi)笔?，導致基因功能喪失?］。

CRISPR?Cas9技術(shù)可以根據(jù)不同實驗的需要進行更加精細的調(diào)整［7］。全基因組的CRISPR篩選幾乎可以應用于任何細胞系和遺傳背景下的基因篩選，如KRAS、EGFR、ALK突變或其他人類腫瘤細胞系。其他遞送方法，如原位移植或靜脈注射，有助于鑒別那些參與腫瘤血管形成和外滲的過程［8］。

近年來，CRISP?Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應用于人類、小鼠、魚、果蠅、酵母、煙草、番茄、水稻、大豆、玉米、小麥等多個物種細胞的基因編輯，科學家們利用CRISPR?Cas9技術(shù)開始進行功能性的基因篩選。CRISPR?Cas9技術(shù)在基因編輯中具有一定優(yōu)越性，可采用誘導基因突變方式進行功能缺失型篩選，更加高效、精準；敲除效率高，具有更廣泛的作用位點及較低的脫靶效率。CRISPR?Cas9基因敲除可用于大部分的基因修飾研究，而且操作相對簡單，可以在普通實驗室進行，將會在定向編輯研究中帶來突破性的發(fā)展［9］。

3 CRISPR?Cas9在腫瘤耐藥中的應用

3.1 CRISPR?Cas9在肝癌耐藥中的應用進展

通過全基因組CRISPR?Cas9文庫篩選，研究者已經(jīng)篩選出在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的抑癌基因AD?AMTSL3、PTEN［10］，以 及 促 癌 基 因NSD1、NCAPG［11，12］，這 證 明 了CRISPR?Cas9文 庫 篩 選 在肝癌耐藥基因篩選中的可行性。索拉非尼是晚期肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的標準治療方法，然而腫瘤細胞可表現(xiàn)出對索拉非尼的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。Wei等［13］通過使用全基因組CRISPR?Cas9文庫篩選，發(fā)現(xiàn)磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）是索拉非尼耐藥的關(guān)鍵驅(qū)動因素。索拉非尼治療后PHG?DH失活會升高活性氧（reactive oxygen species ROS）水平并誘導HCC凋亡。PHGDH抑制劑NCT?503的治療與索拉非尼有協(xié)同作用，可消除體內(nèi)HCC的生長，因此，靶向PHGDH是克服HCC耐藥性的有效方法。使用同樣的方法，Cai等［14］在人類Huh7細胞中發(fā)現(xiàn)LRP8是驅(qū)動HCC細胞獲得索拉非尼耐藥的關(guān)鍵基因，LRP8通過激活β?catenin，增強了其對索拉非尼的耐藥性。Zheng等［15］通過基于模型的全基因組CRISP/Cas9敲除（MAGeCK）分析，KEAP1被確定索拉非尼耐藥性和/或HCC細胞敏感性相關(guān)的非突變機制的必需基因。KEAP1失活后，KEAP1/Nrf2通路的失控通過上調(diào)Nrf2下游基因和降低ROS水平導致治療HCC的索拉非尼、樂伐替尼和雷戈非尼耐藥。此外，通過該方法還篩選出對索拉非尼耐藥的關(guān)鍵基因SGOL1［16］。

3.2 CRISPR?Cas9在肺癌耐藥中的應用進展

化學療法作為單獨或與手術(shù)和放療結(jié)合使用的全身療法，旨在阻止癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并最終誘導癌細胞死亡。目前，癌細胞的耐藥性已成為影響化療療效的主要原因。編輯耐藥基因可提高化療療效和療效。目前，CRISPR?Cas9已被用于研究與肺癌藥物敏感性和耐藥性有關(guān)的基因，如順鉑、卡鉑和紫杉醇等，為提高化療對肺癌的治療效果提供了理論基礎。在H460和H1299細胞中，將RSF1基因與紫杉醇聯(lián)合敲除會導致G1的細胞周期停滯，同時抑制細胞遷移和增殖；在使用H 460細胞的異種移植小鼠肺癌模型中，與野生型相比，敲除RSF1顯著提高了對紫杉醇的敏感性，降低了移植腫瘤的重量（P<0.01）和體積（P<0.05）［17］。在另一項使用肺癌異種移植小鼠模型的研究中，CRIS?PR?Cas9在A 549細胞中敲除了NRF2基因，發(fā)現(xiàn)相對于野生型動物，腫瘤細胞對順鉑和卡鉑敏感，移植瘤的體積明顯降低［18］。在NSCLC細胞系中，CRISPR?Cas9敲除極光B（AURKB）導致腫瘤的恢復，抑癌基因TP53的表達，恢復了對順鉑和紫杉醇的敏感性［19］。另一項研究表明，CRISPR?Cas9敲除ERCC1會使癌細胞對順鉑高度敏感［20］。肺癌對化療藥物耐藥性的研究為提高藥物敏感性和降低或消除肺癌對化療藥物的耐藥性提供了科學依據(jù)。

3.3 CRISPR?Cas9在乳腺癌耐藥中的進展

雌激素受體（estrogen receptor，ER）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor recep?tor 2 HER2）突變在乳腺癌治療耐藥中作用關(guān)鍵，CRISPR?Cas9系統(tǒng)可用于靶向乳腺癌患者的ER或HER2突變體。sgRNA被設計為靶向ER或HER2突變外顯子中的特定序列，以修復突變，消除致癌突變。同時，CRISPR?Cas9還可以破壞ER或HER2的特定功能域，使癌細胞失去了獲得性耐藥性［21，22］。使 用CRISPR?Cas9技 術(shù) 使 得 兩 種 三 陰 性乳腺癌（triple?negative breast cancer，TNBC）細胞系MDA?MB?231（野生型）和MDA?MB?436（BRCA 1 m）產(chǎn)生缺陷，可使TNBC細胞對3種代表性的化學治療乳腺癌藥物阿霉素、吉西他濱和多西他賽更加敏感［23］。使用同樣的細胞系，使用CRISPR?Cas9進行CXCR4或CXCR7基因的單敲除后，可顯著抑制TNBC細胞的惡性進展，用于乳腺癌治療耐藥靶標［24］?？傊?，CRISPR?Cas9系統(tǒng)可恢復耐藥基因突變并確定耐藥性乳腺癌的潛在耐藥靶標。CRIS?PR?Cas9系統(tǒng)有望在預防乳腺癌治療耐藥中發(fā)揮重要作用，成為個性化醫(yī)學的重要工具［25］。

3.4 CRISPR?Cas9在其它疾病耐藥中的應用

CRISPR?Cas9文庫早期經(jīng)常應用于藥物作用基因篩選。Shalem等［26］設計了CRISPR?Cas9基因敲除文庫，并命名為GeCKO（Genome?scale CRIS?PR?Cas9 knockout）文 庫。加 入vemurafenib抑 制A 375細胞的生長，進而富集少數(shù)具有vemurafenib抗性的細胞，其中nf2、cul3、tada2b和tada1與vemu?rafenib抗性無關(guān)。這些候選基因為vemurafenib腫瘤的耐藥機制提供了新的假說。研究者還證明了CRISPR?Cas9用 于 耐 藥 基 因 篩 選 的 可 靠 性［27］。Zhou等［28］設計了一個針對這291個靶向基因，除已知的炭疽受體Antxr1外含有869條sgRNA基因的慢病毒聚焦人力資源庫。這種聚焦文庫減少了篩選范圍、實驗成本及操作難度。選擇合適的庫容量可以更有效地篩選庫，提高實驗成功率。

4 展望

CRISPR?Cas9基因組編輯技術(shù)是二十一世紀的一項重大的科學突破，推動了生命科學相關(guān)領(lǐng)域的研究，對基礎科研領(lǐng)域產(chǎn)生了革命性的影響，在未來，CRIS?PR?Cas9技術(shù)的應用也必將越來越廣泛。自2014年以來，利用該技術(shù)研究人員在藥物靶標發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、藥物敏感基因研究、病毒宿主研究等領(lǐng)域取得了巨大的成功。基于CRISPR?Cas9的高通量功能性篩選技術(shù)將成為功能基因研究的首選工具。