劉 湘，張 玥，公茂旺，劉效敏，趙亞男

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周圍血管病科，山東 濟南250014；3.泰安市中醫(yī)二院，山東 泰安271000；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院運動損傷骨科，山東 濟南250014）

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是以肢體突發(fā)粗腫、脹痛為臨床表現(xiàn)的靜脈回流障礙性疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DVT屬于“股腫”“脈痹”“瘀血流注”等范疇。瘀熱互結(jié)之病機始終存在于DVT的病變過程中，因此清熱解毒、涼血散瘀為首要治法［1］。四妙勇安湯是治療熱毒熾盛之脫疽的經(jīng)典名方，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草4味中藥組成，因其具有的清熱解毒、活血通絡(luò)之功效契合瘀熱互結(jié)之病機而被常用于治療包括DVT在內(nèi)的各種周圍血管疾病，并取得了顯著療效［2?4］。但是四妙勇安湯治療DVT的機制尚需進一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運用網(wǎng)絡(luò)對藥物與疾病進行分析且融合多項學(xué)科的新興學(xué)科，具有整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點［5］。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，整合分析數(shù)據(jù)庫中藥物與疾病的信息，構(gòu)建藥物?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)，以探究四妙勇安湯治療DVT的作用機制。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯有效成分篩選

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取四妙勇安湯中金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的有效成分，按照口服生物利 用 度（oral bioavail?ability，OB）≥30，類 藥 性（drug?likeness，DL）≥0.18的條件對有效成分進行篩選。

1.2 有效成分作用靶點獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘有效成分的作用靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將作用靶點的名稱作標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 DVT靶點的獲取

在CTD數(shù)據(jù)庫中以“deep venous thrombosis”為關(guān)鍵詞檢索DVT的相關(guān)靶點，并以“inference score≥30”為條件對獲得的靶點進行篩選。

1.4 蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過EXCEL將有效成分作用靶點與DVT靶點取交集，去除重復(fù)值后得到四妙勇安湯治療DVT的關(guān)鍵靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)之間的相互作用進行預(yù)測，得到關(guān)鍵靶點之間的關(guān)系。

1.5 構(gòu)建藥物?成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物?成分?靶點?疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點（Node）分別代表中藥、成分、靶點與疾病，節(jié)點之間通過邊（Edge）來連接。根據(jù)節(jié)點度值（Degree）的大小篩選出網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點。

1.6 四妙勇安湯治療DVT通路富集分析

運用Cytoscape 3.7.2中CluoGO v2.5.5插件GO Biological Process來分析四妙勇安湯有效成分治療DVT靶點生物過程，運用KEGG以“P<0.01”對獲取的治療DVT的通路進行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分篩選

根據(jù)篩選條件，在TCMSP中篩選出金銀花有效成分23個，玄參有效成分9個，當(dāng)歸有效成分2個，甘草有效成分93個。除去重復(fù)的有效成分后，共得到四妙勇安湯121個有效成分。

2.2 有效成分作用靶點

獲取金銀花有效成分作用靶點122個，玄參55個，當(dāng)歸64個，甘草125個。將靶點合并去除重復(fù)值后，共獲得137個作用靶點。

2.3 DVT相關(guān)靶點

從CTD數(shù)據(jù)庫中以“deep venous thrombosis”為關(guān)鍵詞、以“inference score≥30”為條件篩選獲取與DVT相關(guān)靶點1 172個。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

經(jīng)過取交集并去除重復(fù)值后，獲得關(guān)鍵靶點80個，并繪制維恩圖，見圖1。在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入四妙勇安湯治療DVT的關(guān)鍵靶點，獲得關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，以及靶點之間的關(guān)系，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點80個，邊925條，平均度值為23.13。度值越高表示該節(jié)點所代表的靶點在網(wǎng)絡(luò)中的作用越高。將相互連接的靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進行分析，結(jié)果顯示IL6、TP53、EGF、VEGFA、JUN、TNF、EGFR、MAPK1、ESR1等靶點度值較高，作用較為重要。

2.5 藥物?成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖1 四妙勇安湯有效成分作用靶點與DVT相關(guān)靶點交集Fig 1 Intersection of the effect targets of active compo?nents of Simiao Yong'an Decoction and DVT?re?lated targets

運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建藥物?成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)由193個節(jié)點組成，其中4個中藥節(jié)點、108個成分節(jié)點、80個靶點節(jié)點和1個疾病靶點，六邊形代表疾病節(jié)點，橢圓形代表中藥節(jié)點，菱形代表成分節(jié)點，矩形代表靶點節(jié)點。節(jié)點的Degree值越大，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。根據(jù)Degree值大小篩選出核心成分和靶點，結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、β?谷甾醇（beta?sitosterol）、山奈酚（kaempferol）等有效成分以及雌激素受體1（es?trogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（androgen re?ceptor，AR）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/h synthetase 2，PTGS2）等靶點是該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，表明這些節(jié)點是四妙勇安湯治療DVT的重要成分或靶點，見表1。

表1 四妙勇安湯治療DVT的核心節(jié)點Tab 1 Core nodes of Simiao Yong'an Decoction in the treat?ment of DVT

圖2 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of key targets

2.6 藥物?成分?靶點?疾病通路分析

通過ClueGO將四妙勇安湯治療DVT的生物過程和通路進行分析，運用GO Biological Process并選擇P<0.01的生物過程，共214條，關(guān)鍵靶點富集顯著的前5條生物過程，為對無機物的反應(yīng)（33個靶點），細(xì)胞成分運動的正向調(diào)節(jié)（29個靶點），對有毒物質(zhì)的反應(yīng)（29個靶點），細(xì)胞遷移的正調(diào)控（28個靶點），氧化應(yīng)激反應(yīng)（27個靶點），見表2。證明四妙勇安湯治療DVT的作用可通過參與多種生物過程而達到。

圖3 四妙勇安湯治療DVT的藥物?成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Drug?component?target?disease network of Simiao Yong'an Decoction in the treatment of DVT

運用KEGG進行通路富集分析，以P<0.01共得到72條通路，見圖4。結(jié)果表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGE）?糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of AGE，RAGE）信號通路、PI3K?Akt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信 號 通路、白細(xì)胞介素?17（IL?17）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、松弛素（re?laxin，RLX）信號通路等通路是關(guān)鍵靶點顯著富集的通路。

表2 四妙勇安湯治療DVT關(guān)鍵靶點的生物過程分析Tab 2 Biological process analysis of key targets of DVT treated by Simiao Yong'an Decoction

圖4 KEGG獲得的藥物?成分?靶點?疾病通路Fig 4 Drug?component?tar get?disease pathway obtained by KEGG

3 討論

四妙勇安湯原載于鮑相璈所著的《驗方新編》，是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的經(jīng)典名方之一［6］。方中金銀花味甘性寒，尤善清熱解毒；玄參長于清熱涼血，瀉火解毒；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒、活血止痛之功。研究結(jié)果顯示，槲皮素、β?谷甾醇和山奈酚等為四妙勇安湯治療DVT的重要有效成分，可通過作用于ESR1、AR、PTGS2等關(guān)鍵靶點和參與AGE?RAGE信號通路、PI3K?Akt信號通路、MAPK信號通路、IL?17信號通路、TNF信號通路、RLX信號通路等達到治療DVT的作用。

四妙勇安湯的有效成分：槲皮素是一種多醇羥基黃酮類化合物。Sapha等［7］通過運用槲皮素治療I型糖尿病小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制血小板聚集以及血小板致密顆粒胞吐作用，降低血液的黏滯程度，延遲血栓的形成。β?谷甾醇是一種廣泛存在于各種植物油、堅果等植物種子中的植物甾醇，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用［8］。牙啟康等［9］將榕樹須抗血栓作用的活性部位分離后得到的7個化合物，其中就包括β?谷甾醇，證實了其抗血栓的作用。Choi等［10］證實β?谷甾醇能夠減少TNF?α、IL?1β等炎性因子的分泌，發(fā)揮其抗炎作用。另有研究表明，β?谷甾醇在體外具有溶栓活性，在體內(nèi)能夠發(fā)揮抗凝活性［11］。山奈酚是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚能夠抑制纖維蛋白聚合物的形成，減弱凝血酶刺激血小板中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2等酶的磷酸化，延遲凝血時間［12］。這3種有效成分在藥物?成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)中作用的靶點多，度值較高，具有抗凝、抗炎、溶栓的藥理作用，是四妙勇安湯治療DVT的重要成分。

作用關(guān)鍵靶點：ESR1、AR、PTGS2等是網(wǎng)絡(luò)中的核心關(guān)鍵靶點。ESR1是雌激素受體的一種亞型。研究表明，ESR1能夠調(diào)節(jié)血小板前體蛋白的代謝，抑制血小板β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）生成，而血小板Aβ的過度生成可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，因此ESR1對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護作用［13］。AR是一種主要分布于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的核受體。研究發(fā)現(xiàn)，雄激素能夠調(diào)控雄激素依賴性組織因子途徑抑制物調(diào)節(jié)蛋白（ADTRP）的水平，起到防治冠狀動脈疾病、血栓形成等疾病的作用［14］。PTGS2基因的表達產(chǎn)生環(huán)氧合酶?2（cyclooxygen?ase?2，COX?2），環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）參與花生四烯酸合成血栓素A2的過程，進而促進血小板聚集。正常情況下COX?2的表達量很低，當(dāng)血管壁受損或者受到多種炎性因子刺激時，血管平滑肌細(xì)胞COX?2的表達就會增多［15］。這些靶點是有效成分作用較多的靶點，與血管內(nèi)皮、血栓形成、血小板聚集密切相關(guān)，為四妙勇安湯治療DVT的核心靶點。

信號通路：AGE?RAGE信號通路與炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、血管等多方面密切相關(guān)［16］。AGE與RAGE的特異性結(jié)合能夠誘導(dǎo)一系列信號傳導(dǎo)途徑，引發(fā)血管收縮、炎癥反應(yīng)等，從而導(dǎo)致血栓形成［17］。PI3K?Akt和MAPK信號通路在血小板聚集活化中發(fā)揮著重要作用［18，19］。血小板受到激動劑刺激時，血小板表面的P2Y 1和P2Y 12受體與對應(yīng)的G蛋白發(fā)生偶聯(lián)，磷脂酰肌醇3激酶β（PI3Kβ）使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3能夠激活PI3K的下游蛋白Akt，從而導(dǎo)致血小板活化聚集以及血栓形成等反應(yīng)［20］。MAPK由ERK、JNK等蛋白組成，這些蛋白可在血小板中表達，磷酸化水平會在激動劑的刺激下升高，并參與調(diào)節(jié)血小板的活化聚集［21］。炎癥反應(yīng)與血栓形成同屬宿主反應(yīng)，炎癥能促發(fā)血栓，而DVT中有炎癥反應(yīng)參與。炎性細(xì)胞因子作為炎癥敏感標(biāo)志物與DVT的發(fā)生密切相關(guān)［22］，IL?17信號通路和TNF信號通路均屬炎性反應(yīng)通路。IL?17是強大的促炎細(xì)胞因子，能夠促進中性粒細(xì)胞的聚集和細(xì)胞因子的釋放，推動炎癥的發(fā)展［23］。TNF?α能夠直接損傷血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板活化因子（platelet activated fac?tor，PAF），抑制蛋白C活化，促使血栓形成［24］。研究發(fā)現(xiàn)，IL?17和TNF?α相結(jié)合時，可以增加血小板聚集，減弱抗凝作用，導(dǎo)致血栓形成［25］。因此，四妙勇安湯可以通過發(fā)揮抗炎作用，從而抑制血栓的蔓延。RLX是一種肽類激素，能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞因子及黏附分子的表達和抑制單核細(xì)胞的黏附［26］，可以改善內(nèi)皮依賴性血管反應(yīng)，改善血管功能［27］。以上通路均為關(guān)鍵靶點顯著富集的通路，與炎癥反應(yīng)、血小板聚集、血栓形成等關(guān)系密切，有效成分可能通過介導(dǎo)多條通路來發(fā)揮其藥理作用治療DVT，體現(xiàn)出四妙勇安湯多通路、多靶點的協(xié)同作用機制。

綜上所述，四妙勇安湯中的多種成分可能通過作用于多個靶點和介導(dǎo)多項通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗凝、保護血管內(nèi)皮的作用，從而達到治療DVT的效果。然因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中收錄中藥信息不完全、成分與靶點篩選上存在主觀因素以及未進行實驗研究，所以本研究存在一定的局限性，四妙勇安湯治療DVT的作用機制還有待做深層次的研究加以驗證。