牟 豪，趙光夫，余遠迪，許國洋，楊 柳*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.四川大學 生命科學學院，四川 成都 610064;3.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,重慶 榮昌 402460)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)屬于雙鏈DNA病毒，基因組為170～193 kb，無內(nèi)含子，共編碼150～167個病毒蛋白。ASFV是一種對于養(yǎng)豬業(yè)危害極其嚴重的病毒，具有高致死性和強傳染性的特點，每年該病對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失。在我國，ASFV屬于一類動物疫病，同時在國際上也屬于世界動物衛(wèi)生組織(OIE)管制檢測疫病類型。ASFV的宿主特異性比較強，主要感染豬，包括家豬和野豬，不能感染人類，故不屬于人畜共患病。該病毒在臨床上可引起肺水腫、發(fā)燒、皮膚發(fā)紺、臟器黏膜出血等癥狀，其高毒力毒株能在短時間內(nèi)導致豬的發(fā)病死亡，病死率高達100%[1]。遺憾的是，盡管ASFV的疫苗研究已有幾十年的時間，但目前市面上尚無針對ASFV保護性很強的商用疫苗，使得ASFV的防范工作難度進一步加大[2-4]。我國于2018年8月首次向OIE上報了ASFV疫情[5]，且至今仍存在散發(fā)疫情。因此，了解ASFV的侵染機制以及疫苗研究進展對于未來控制ASFV疫情具有重要的意義。

1 ASFV浸染細胞方式及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運

1.1 ASFV浸染細胞方式ASFV進入細胞的過程非常復雜，可以通過多種機制侵染細胞，同時取決于多種因素，包括溫度、膽固醇、能量和pH，以及需要依賴多個細胞因子[6]。ASFV擁有強大的細胞感染能力，當病毒感染復數(shù)為50～80時，只需要30 min就可以浸染高達60%的Vero細胞[7]。

前期研究認為，ASFV是通過受體介導的內(nèi)吞途徑進入細胞，并能短暫寄宿于內(nèi)吞體。一旦內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境pH降低到一定程度，ASFV便會穿透內(nèi)吞體進入細胞質(zhì)中[8]。隨后研究證實，ASFV進入細胞的內(nèi)吞途徑主要由網(wǎng)格蛋白介導(clartin mediated)和發(fā)動蛋白介導(dynamin mediated)。相較于其他內(nèi)吞方式而言，網(wǎng)格蛋白介導的吞噬作用是效率最高的胞內(nèi)外物質(zhì)交換方式。通過網(wǎng)格蛋白介導的吞噬作用，ASFV可以在幾秒鐘以內(nèi)進入細胞，并且在1～15 min 就能在內(nèi)吞體中檢測到ASFV病毒顆粒[9]。發(fā)動蛋白是一種GTP酶，其能在細胞內(nèi)膜的小窩中發(fā)生聚集，并通過水解GTP的方式調(diào)節(jié)自身發(fā)生收縮，進而導致細胞膜發(fā)生凹陷，最后再剪切質(zhì)膜并形成吞噬小泡，而胞外物質(zhì)可以通過凹陷處被吞噬進入細胞。相應地，使用發(fā)動蛋白抑制劑能在體外顯著性地限制ASFV對靶細胞的感染[9]。

除了依賴吞噬途徑進入細胞外，ASFV也能通過大胞飲的方式進入細胞。據(jù)報道，有一大部分ASFV是通過大胞飲進入到巨噬細胞，且使用大胞飲的抑制劑處理之后能夠顯著性降低ASFV進入巨噬細胞的能力[6,10]。從機制上來講，大胞飲的產(chǎn)生依賴于細胞膜局部的不穩(wěn)定性，暗示ASFV能夠降低細胞膜局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而通過大胞飲來進入細胞。

值得注意的是，已發(fā)表的研究結(jié)果多是通過使用內(nèi)吞抑制劑來研究ASFV侵染細胞的機制，但內(nèi)吞抑制劑均存在較為嚴重的非特異性的問題，比如氯丙嗪在抑制網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞的同時也會對大胞飲產(chǎn)生抑制作用[11]。此外，不同研究者在研究ASFV侵染細胞的機制時所采用的受體細胞也存在差異。因此，目前不能簡單地認為ASFV是依賴于某一種或一類內(nèi)吞途徑侵染細胞，未來需要采用更新更準確的方法來進行相關(guān)研究。

1.2 ASFV 胞內(nèi)轉(zhuǎn)運ASFV一旦經(jīng)過內(nèi)吞途徑進入細胞后，會沿著內(nèi)吞途徑寄宿于早期內(nèi)吞體(early endosome)、晚期內(nèi)吞體(late endosome)，最后到溶酶體(lysosome)[6]。

CUESTA-GEIJO等[9]發(fā)現(xiàn)，ASFV僅需要1～15 min 就能從胞外通過吞噬作用進入Vero細胞的早期內(nèi)吞體中，并檢測到ASFV的衣殼層關(guān)鍵蛋白p72。早期內(nèi)吞體形成后會隨著內(nèi)吞途徑進一步形成晚期內(nèi)吞體，而早期內(nèi)吞體和晚期內(nèi)吞體的表面標記有著明顯差異：早期內(nèi)吞體的表面標記主要是EEA1，而晚期內(nèi)吞體的表面標記主要是RAB7或CD63。另外，早期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)吞體的過程中，其囊泡膜上的v-ATPase泵會將胞質(zhì)中的H+離子泵入囊泡內(nèi)引起囊泡內(nèi)環(huán)境酸化。早期內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)吞體過程中，隨著內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境pH的降低，ASFV會發(fā)生脫殼效應，此時，在光電子顯微鏡下不能觀察到其二十面體的形態(tài)特征，但如果使用抗ASFV核心蛋白的抗體檢測仍然能夠檢測到ASFV[6,12]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用v-ATPase的抑制劑可以顯著抑制ASFV在細胞質(zhì)中的復制，并且能夠在晚期內(nèi)吞體中觀察到大量的帶有完整衣殼的ASFV[13]。這一現(xiàn)象也說明，ASFV感染依賴于內(nèi)吞體內(nèi)環(huán)境的酸化所導致的ASFV脫殼效應。

ASFV發(fā)生脫殼效應之后，會將自己的內(nèi)核膜與內(nèi)吞體膜融合，釋放核心組分進入細胞質(zhì)中發(fā)生復制。這一個過程是依賴ASFV內(nèi)膜層上的一個穿膜多肽pE248R蛋白來完成的[6]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)ASFV會促進整個內(nèi)吞過程，使內(nèi)吞體累積在細胞核周圍的ASFV “病毒工廠”附近，利用內(nèi)吞體內(nèi)的膽固醇和膜上磷脂酰肌醇(phosphoinositides)為ASFV的膜融合以及ASFV的復制提供原料[14]。最新的研究表明，ASFV感染后還會導致細胞內(nèi)膽固醇向“病毒工廠”富集，而細胞膜上負責運輸膽固醇脂類轉(zhuǎn)運體包括羥固醇綁定蛋白(oxysterol-binding protein，OSBP)和膽固醇綁定蛋白(OSBP-related proteins，ORP)介導了該過程。使用OSBP抑制劑伊曲康唑(itraconazole，ITZ)處理細胞后，能夠在不影響OSBP定位的情況下顯著抑制ASFV的復制[15]?？紤]到脂類的轉(zhuǎn)運可能對ASFV的膜融合和病毒復制起到至關(guān)重要的作用，那么阻止“病毒工廠”所需要的脂類轉(zhuǎn)運可能會極大地限制ASFV感染。據(jù)報道，在其他病毒(如丙型肝炎病毒)感染過程中，通過抑制其脂類運輸過程能夠顯著限制其感染[16]。

2 ASFV疫苗的研究現(xiàn)狀

早在1950年就有報道，ASFV感染康復后的豬能夠抵御相同毒力ASFV的感染[17]，意味著ASFV疫苗研發(fā)擁有良好的前景，但由于種種原因直到現(xiàn)在都還沒有一個成熟可用的ASFV疫苗。限制ASFV疫苗發(fā)展的一個重要因素是ASFV具有強大的免疫逃逸能力，包括先天性免疫和適應性免疫。例如：ASFV的CD2v蛋白能夠抑制淋巴細胞的增殖，促進病毒的感染；A238L基因能夠抑制NF-κB和NEAT的激活，同時抑制一氧化氮的釋放[18]；MGF360和MGF530/505基因能夠抑制Ⅰ型干擾素等一系列炎性因子的釋放，提升感染細胞的存活能力[19]。即便如此，在過去幾十年里，研究者在ASFV疫苗領域仍取得了一定的進展。目前，針對ASFV開發(fā)的疫苗類型主要分為3種：滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亞單位疫苗。

2.1 ASFV滅活疫苗滅活疫苗是最常見的疫苗類型，已有多種感染性疾病通過滅活苗得到了有效的控制[20]。但是，滅活疫苗往往對于某些復雜的病毒起不到保護作用。前期有研究通過給豬群免疫經(jīng)滅活的ASFV感染的巨噬細胞和滅活的ASFV，發(fā)現(xiàn)并不能給豬提供有效保護[21]。2014年，BLOME等[22]將滅活的ASFV與不同免疫佐劑混合免疫豬群，發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗同樣不能給豬群提供有效的保護。從目前看來，ASFV滅活疫苗的方式可能成功率不高。其原因可能是，ASFV在體內(nèi)感染過程中表達的蛋白譜和體外培養(yǎng)條件下表達的蛋白譜差異很大，滅活疫苗不能產(chǎn)生足夠的保護性抗體。

2.2 ASFV弱毒疫苗弱毒疫苗是通過病毒或細菌在體外或非宿主動物體內(nèi)的連續(xù)傳代制成。弱毒疫苗與滅活疫苗相比，弱毒疫苗能夠持續(xù)性誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性抗體。不少研究者也嘗試通過給豬群免疫自然獲得的弱毒ASFV或體外致弱的ASFV，但其效果并不理想，免疫豬群往往出現(xiàn)嚴重的不良反應[23]，原因可能是弱毒疫苗依然是活病毒。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，通過感染非敏感性細胞(如：Vero細胞)致弱后的ASFV毒株在豬群體內(nèi)復制的能力顯著性下降，毒力基因的表達也同時下降，導致動物不能產(chǎn)生足夠強的免疫反應[24]。隨著對ASFV病原學的深入研究，鑒定出了越來越多的ASFV毒力相關(guān)基因，與此同時，出現(xiàn)了一些基因缺失弱毒疫苗。與傳統(tǒng)的自然選擇或體外選擇弱毒疫苗相比，基因缺失弱毒疫苗是基于ASFV病原學進行的定向突變，其蛋白質(zhì)組信息更加清晰，安全性與可靠性也更高。已經(jīng)有一些基因缺失弱毒疫苗在試驗中對豬群起到了較好的保護作用。比如，GALLARDO等[25]報道，缺失了A224L和EP153R基因的NH/P68ΔA224L和NH/P68ΔEP153R弱毒苗能夠保護豬群對同源ASFV毒株的感染；以及缺失MGF360基因的BeninΔMGF弱毒苗免疫豬群后能夠?qū)姸局戤a(chǎn)生免疫保護效果[26]。以及近日CHEN等[27]報道，1株缺失了7個基因的弱毒疫苗株HLJ/18-7GD，免疫SPF豬、商品豬以及妊娠母豬后可以產(chǎn)生非常好的保護作用，這可能是一種安全有效的疫苗，有望在控制ASFV傳播方面發(fā)揮重要作用。2020年6月10日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新聞辦公室發(fā)布了哈爾濱獸醫(yī)研究所自主研發(fā)的1株基因缺失疫苗環(huán)境釋放和臨床試驗進展順利的相關(guān)消息。該疫苗是于2020年3月獲農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品臨床試驗批件，按照臨床試驗方案，于2020年4月上旬、5月上旬和6月上旬分別在黑龍江、河南和新疆等3個基地啟動疫苗臨床試驗。截止6月底，該疫苗株環(huán)境釋放試驗表明疫苗接種仔豬生長狀態(tài)良好，無異常臨床狀況；疫苗接種母豬狀態(tài)良好，無異常臨床表現(xiàn)，無異常發(fā)情、無流產(chǎn)；免疫豬無疫苗毒排放，無水平傳播；免疫后大部分母豬已產(chǎn)仔，免疫組與對照組產(chǎn)仔、死胎率無顯著性差異，仔豬生長狀況良好?？偟膩碚f，弱毒疫苗，尤其是基因缺失弱毒疫苗給ASFV的防制帶來了希望。

2.3 ASFV亞單位疫苗亞單位疫苗是通過化學或生物手段，選取細菌或病毒具有免疫保護活性的蛋白或核酸所制成的疫苗，因此被認為是最安全的疫苗類型。ASFV病原學的研究揭示了不少關(guān)于ASFV黏附和進入細胞過程中的關(guān)鍵蛋白，如p30、p54、pp220、pp62、p72和CD2v等，這些關(guān)鍵蛋白均可以作為ASFV亞單位疫苗的候選靶點[28-29]。據(jù)報道，利用桿狀病毒表達的p54、p30和p72蛋白作為亞單位疫苗對豬群進行免疫，其產(chǎn)生的中和性抗體能給豬群提供部分保護作用[30-21]。另據(jù)報道，通過對豬群免疫p54和p30的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其能誘導產(chǎn)生具有保護性的體液免疫[32]。但是，也有報道稱同樣使用桿狀病毒表達ASFV的p22、p30、p54和p72蛋白免疫豬群后，發(fā)現(xiàn)并不能提供足夠的免疫保護作用[33]。這看似矛盾的結(jié)果可能是因為試驗設計的不同，并不能因此直接否認ASFV亞單位疫苗的價值。

2.4 ASFV基因疫苗CD8陽性T細胞在抗體介導的免疫反應中起到了舉足輕重的作用，所以ASFV的DNA疫苗也成為一個熱門的研究領域。DNA疫苗與亞單位蛋白疫苗不同，DNA疫苗能誘導宿主細胞從細胞內(nèi)表達病毒蛋白，能直接通過MHC-Ⅰ分子呈遞給CD8陽性T細胞進行識別，從而進一步激活后天免疫流程[34]。LACASTA等[35]通過將ASFV的開放閱讀框(ORFs)文庫和泛素共表達來作為DNA疫苗免疫豬群，發(fā)現(xiàn)可以為豬群提供有效的免疫保護，其保護機制可能包括誘導CD8陽性T細胞介導的體液免疫，并且篩選到了多個保護性抗原。鑒于有些蛋白或肽段并不能穩(wěn)定的誘導保護性抗體的產(chǎn)生，已經(jīng)有很多研究人員將病毒DNA和蛋白共表達來作為一種新型DNA疫苗。但遺憾的是，將ASFV的DNA(CD2v、p72、p32、±p17)和蛋白(p15、p35、p54、±p17)作為DNA疫苗免疫豬群并不能產(chǎn)生保護性免疫反應[36]。

總之，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過55個具有免疫原性的ASFV蛋白和44個ASFV新的病毒多肽[37-38]。但是，還不清楚這些蛋白或多肽是否具有完整的免疫保護性。目前，亞單位疫苗研究中，需要找到一個穩(wěn)定的抗原靶標，同時也需要進一步發(fā)現(xiàn)更多具有免疫原性的蛋白。盡管現(xiàn)在亞單位疫苗僅能誘導出部分免疫保護作用，還不能作為真正的疫苗使用，但依賴著它具有高安全性等優(yōu)點，在該領域的進一步研究是極具意義的。

近年來，重組病毒載體疫苗作為一種新型的基因工程疫苗受到了廣泛的關(guān)注。目前，有研究團隊用重組病毒載體表達多個ASFV抗原來免疫豬群，盡管攻毒免疫豬群依然會出現(xiàn)了感染癥狀，但免疫豬群血液和淋巴組織載毒量較正常豬群發(fā)生了顯著性下調(diào)[38]。在我國，張會雷等[39]將ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白p72和p54或CD2v和p30的基因分別插入到痘苗基因組中，構(gòu)建了同時表達p72和p54的重組痘苗病毒以及同時表達CD2v和p30的重組痘苗病毒，為ASFV重組病毒載體疫苗研發(fā)奠定了前期基礎。

3 小結(jié)與展望

盡管ASFV現(xiàn)在在我國的流行得到了一定的控制，但想要從根本上控制或清除該病毒還需要很長時間的努力。疫苗作為控制流行病的有效武器，在控制和凈化ASFV的工作中將扮演重要角色。想要制作出保護性良好的疫苗，必然需要病原學的深入研究作為基礎。在疫苗研究方面，亞單位疫苗有著便利性和安全性高等特點，但是目前看來，也許基因缺失的弱毒疫苗更具有應用前景，而滅活苗可能不適用于作為ASFV的疫苗。新型重組病毒載體疫苗為應對ASFV感染提供了新的研究思路，但是從本課題組對以羊痘病毒為載體的重組病毒疫苗的研究現(xiàn)狀來看，受制于病毒的重組效率低以及重組毒株的篩選難度大，重組病毒載體疫苗的研發(fā)及應用可能面臨極大的挑戰(zhàn)。