蔣潤 周激波

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase proteins，MMPs）是一類鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶，可存在于多種器官及系統(tǒng)中。根據(jù)其底物、自身結(jié)構(gòu)及細(xì)胞定位可將MMPs分為膠原蛋白酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型金屬蛋白酶以及基質(zhì)溶解素這幾種類型[1，2]。

MMP-2是MMPs家族中的第二個(gè)成員，為IV型膠原酶，又稱明膠酶A。人類MMP-2基因編碼分子量約72 kDa的酶原，經(jīng)水解后活化為65 kDa的活性形式，活化后可與多種膠原底物相結(jié)合。與MMPs的其他成員一樣，MMP-2在組織重塑、胚胎發(fā)育、傷口愈合、血管生成和炎癥等生理方面起著重要的作用[3]。

MMP-2 的異常表達(dá)近年來被證明與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如肺癌[4]、消化道腫瘤[5]、心肌梗死[6]等。MMP-2在許多眼科疾病中也起著重要作用，例如高度近視、圓錐角膜、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、脈絡(luò)膜新生血管等。因此MMP-2在眼內(nèi)的表達(dá)和檢測成為研究眼疾病發(fā)生機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[7，8]?，F(xiàn)筆者對此方面的研究進(jìn)行總結(jié)。

1 MMP-2在淚液和房水中的檢測

淚液作為人眼中可無創(chuàng)獲得的檢測樣本，能從健康人身上獲取以作為陰性對照，對研究有很好的參考價(jià)值。2001年，英國科學(xué)家Smith與其研究團(tuán)隊(duì)從健康受試者和患有各種活動(dòng)性眼病的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的淚液中獲得實(shí)驗(yàn)樣品，通過酶譜法觀察所有樣品的MMP，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性眼病患者的淚液中主要累積了MMP-2和MMP-9，比較樣品中明膠酶酶譜活性特征，推斷出這些MMP主要來源于粒細(xì)胞，淚液中MMP的積聚并非活動(dòng)性潰瘍性角膜炎患者獨(dú)有；可在相關(guān)特應(yīng)性疾病的患者身上檢測到酶，如圓錐角膜、皰疹性眼病以及全身和非系統(tǒng)性干眼病[9]。2012 年，澳大利亞科學(xué)家Balasubramanian團(tuán)隊(duì)取正常人群和圓錐角膜交聯(lián)手術(shù)后患者淚液進(jìn)行MMP-2蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，普通人群為（37.1±4.8）FIU/mg，圓錐角膜患者約為（52.0±8.2）FIU/mg，兩者差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)值上來看，圓錐角膜患者的MMP-2含量更高[10]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也不乏淚液MMP-2的檢測。2013年，澳大利亞Andrea Petznick團(tuán)隊(duì)研究在角膜上皮創(chuàng)傷后淚液成分的變化，對18只實(shí)驗(yàn)室短毛貓隨機(jī)選擇的眼睛進(jìn)行角膜上皮清創(chuàng)術(shù)，在基線和各愈合階段收集眼淚，將正常眼用作對照，使用明膠酶譜法分析淚液MMP活性，免疫組化法評估MMP在眼組織中表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)顯示在上皮遷移和傷口閉合期間角膜中MMP-2表達(dá)增加，在角膜愈合過程中，淚腺M(fèi)MP-2的免疫染色升高，而瞼板腺的變化很小或沒有變化。結(jié)膜相關(guān)淋巴組織顯示弱MMP-2染色[11]。

房水中也檢測到MMP-2的存在。2014年，JIA團(tuán)隊(duì)分別收集了近視和白內(nèi)障患者的房水，通過LuminexxMAP技術(shù)分析了房水中MMPs和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）水平，并分析其水平和眼軸長度（Axial，AL）之間的關(guān)系，首次在人類房水中檢測到MMP-2、MMP-3、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3，且與AL呈正相關(guān)[12]。2018年，王理論團(tuán)隊(duì)選取110例確診并接受治療的原發(fā)性青光眼患者與68例原發(fā)性白內(nèi)障患者的房水，采用酶聯(lián)免疫法檢測其中MMP2，對比發(fā)現(xiàn)青光眼患者房水中的MMP-2含量增多[13]。

由于在臨床中很難獲取正常人群的房水，通常選用接受透明晶狀體置換術(shù)或白內(nèi)障手術(shù)的患者的房水作為正常對照，房水中蛋白含量較少，具有一定的局限性。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可以取材到眼部組織，但又因?yàn)閯?dòng)物眼球較小，對動(dòng)物眼房水的測定至今仍較少。

2 MMP-2在角膜與鞏膜中的檢測

MMP-2在角膜中的研究已有二十多年的歷史。正常人類角膜主要來源為捐獻(xiàn)，病理角膜來源于角膜移植術(shù)。

1992 年，美國M.ElizabethFini團(tuán)隊(duì)利用免疫組化的方法從捐獻(xiàn)的正常角膜組織和圓錐角膜中，證明提取出的是中性明膠酶MMP-2 和MMP-9 的促激活形式和活化形式。但是正常和圓錐角膜在可提取的中性明膠酶的量或亞型沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也沒有顯示它們在培養(yǎng)中合成的量或亞型[14]。1998年，Zhou團(tuán)隊(duì)在檢測中也得到類似結(jié)論[15]。而2000 年，Smith團(tuán)隊(duì)通過酶譜法分析來自正常和圓錐角膜的角膜細(xì)胞培養(yǎng)物分泌的MMP-2 活性譜，發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)的早期圓錐角膜的角膜細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)比從培養(yǎng)正常角膜角膜細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)更容易產(chǎn)生MMP-2的活化酶，即MMP-2活性增加[16]。2001年，謝立信團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了正常角膜和圓錐角膜的免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)MMP-2分布于角膜上皮、基質(zhì)與內(nèi)皮中，主要存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外、基質(zhì)纖維板層之間，且圓錐角膜中MMP-2含量明顯增多[17]。其他疾病角膜中MMP-2含量也有研究，2016年，Alessandra Micera團(tuán)隊(duì)收集了40例青光眼患者和23例捐獻(xiàn)者的角膜組織，通過蛋白質(zhì)印跡、酶譜和聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)MMP-2、MMP-7、TGFb-1和VEGF的表達(dá)異常，但在青光眼亞型之間未檢測到蛋白質(zhì)表達(dá)的差異[18]。

研究者在多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測角膜與鞏膜中的MMP-2，例如雞、兔子、豚鼠[19-21]等。其中MMP-2在近視中的作用得到了廣泛的研究。2017年，Xi團(tuán)隊(duì)構(gòu)建高度近視散光小雞模型，檢測角膜與鞏膜的5個(gè)區(qū)域的MMP-2的mRNA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高度近視散光小雞的角膜與鞏膜上MMP-2的mRNA有更高的表達(dá)[20]。2018 年，Zhou團(tuán)隊(duì)構(gòu)建MMP-2過表達(dá)小鼠，發(fā)現(xiàn)4周后鞏膜MMP-2上調(diào)的小鼠在正常視覺環(huán)境中有明顯的近視，相反，成纖維細(xì)胞特異性MMP-2缺失的小鼠的形覺剝奪性近視發(fā)展減弱27%，證明MMP-2在近視形成過程中起重要的作用[22]。2019年，Jiang團(tuán)隊(duì)構(gòu)建房角關(guān)閉模型的兔子，通過免疫熒光、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbert assay，ELISA），評價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對照組兔子的角膜鞏膜連接處金屬蛋白酶MMP-2，發(fā)現(xiàn)MMP-2染色在小梁網(wǎng)和虹膜中彌漫，MMP-2的免疫熒光信號在房角關(guān)閉后1個(gè)月內(nèi)強(qiáng)烈，隨后變?nèi)鮗19]。

3 MMP-2在晶狀體中的檢測

目前，MMP-2與晶狀體的研究集中在后發(fā)性白內(nèi)障方面，但由于目前后發(fā)性白內(nèi)障的治療方式以YAG激光為主，所以人眼后發(fā)性白內(nèi)障組織樣本較難獲取，目前MMP-2與后發(fā)性白內(nèi)障的研究多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。2008年Li團(tuán)隊(duì)測量MMP-2 在白內(nèi)障手術(shù)前后的不同表達(dá)情況，以探討MMP-2在后囊膜混濁中的可能作用。他們在6只人類捐獻(xiàn)眼中進(jìn)行假性白內(nèi)障手術(shù)，利用免疫組化染色研究前囊膜破裂后人晶狀體上皮細(xì)胞（Lens epithelialcells，LEC）的MMP-2的表達(dá)，并在術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定總MMP-2的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)隨時(shí)間增加，在30 d達(dá)到最大水平，從而證實(shí)MMP-2的改變對后囊膜混濁有影響[23]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也得出了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2007 年，任孝偉團(tuán)隊(duì)對兔子進(jìn)行白內(nèi)障手術(shù)，利用免疫組化檢測MMP-2蛋白以及zymography法檢測MMP-2活性，發(fā)現(xiàn)正常兔晶狀體囊膜中檢測出MMP-2，而術(shù)后實(shí)驗(yàn)組MMP-2含量及活性較對照組增強(qiáng)[24]。

4 MMP-2在玻璃體中的檢測

2000年，Vaughan-Thomas團(tuán)隊(duì)研究對人眼玻璃體的老化是否伴隨著組織內(nèi)降解酶的升高。通過酶譜法檢測供體的玻璃體內(nèi)MMP-2 含量，結(jié)果未顯示MMP-2 含量與年齡有關(guān)[25]。

2014年，Zhuang團(tuán)隊(duì)選擇了26例接受玻璃體切除術(shù)治療黃斑視網(wǎng)膜劈裂或黃斑裂孔的高度近視（High myopia，HM）患者與26 例特發(fā)性黃斑裂孔或黃斑視網(wǎng)膜前膜非高度近視患者，在玻璃體切除術(shù)中獲得玻璃體樣品，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測量玻璃體中MMP-2 的水平，通過熒光法測定MMP活性，結(jié)果顯示HM患者玻璃體中MMP-2水平[（32.40±14.90）ng/ml]明顯高于對照組[（21.42±6.74）ng/ml，P＜0.01]，同時(shí)，HM患者玻璃體樣品中的MMP活性也明顯升高[26]。隨后，2017 年，樊瑩團(tuán)隊(duì)從25 例HM與30例非高度近視進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的患者獲取玻璃體樣本，利用ELISA測量玻璃體內(nèi)MMP-2的濃度，得到了相同的結(jié)論[27]。

其他眼科疾病對玻璃體中MMP-2 含量與活性也有研究。2017年，SonikaRathi團(tuán)隊(duì)對早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變進(jìn)行研究，納入30例早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變患兒以及30例先天性白內(nèi)障患兒，術(shù)中獲取玻璃體樣本，通過蛋白質(zhì)印跡和酶譜法對玻璃體內(nèi)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)活化的MMP-9和（或）MMP-2水平較高，表明其在疾病發(fā)病機(jī)制中有潛在作用[28]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，2010年，德國科學(xué)家Florian Hofmaier團(tuán)隊(duì)構(gòu)建自發(fā)性葡萄炎模型的馬，以健康的馬作為對照組，使用Western印跡定量分析MMP-2和MMP-9表達(dá)，用酶譜法檢查酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性葡萄炎組的玻璃體中MMP-2表達(dá)減少，活性減少，但MMP-9 表達(dá)和活性增加，這些變化反映了自發(fā)性葡萄膜炎中MMPs的變化[29]。

5 MMP-2在后極部的檢測

由于人類眼部取材的局限性，難以獲得眼球后極部的組織，MMP-2在人類眼球后極部的檢測較為少見。

2008 年，顧永昊團(tuán)隊(duì)就增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜疾病和急性視網(wǎng)膜壞死患者視網(wǎng)膜中MMP的表達(dá)情況，術(shù)后獲取視網(wǎng)膜組織，以供體眼視網(wǎng)膜組織作為正常對照，冷凍切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)3個(gè)疾病組的MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，故MMP-2可能在病變中起重要作用[30]。

MMP-2在動(dòng)物眼睛后極部的研究十分多見，其中大鼠和小鼠是最常見的研究對象。2000年，Anders Kvanta團(tuán)隊(duì)將誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管形成的大鼠分為激光治療組與未治療組，通過原位雜交技術(shù)分析MMP-2 mRNA在疾病不同時(shí)期視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的表達(dá)。與未治療組相比，激光治療組的眼睛中，MMP-2 mRNA表達(dá)明顯增加并且主要位于巨噬細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，且侵入脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜下間隙和內(nèi)層視網(wǎng)膜，這種增加在第10天達(dá)到峰值，之后檢測到下降。該現(xiàn)象支持MMP-2 在年齡相關(guān)性黃斑變性中脈絡(luò)膜新生血管發(fā)展中的作用[31]。與之類似，2017 年，鄒俊團(tuán)隊(duì)構(gòu)建高度近視脈絡(luò)膜新生血管的豚鼠模型，通過免疫組化與PCR對激光組與對照組眼睛中視網(wǎng)膜的MMP-2以及MMP-2 mRNA進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持MMP-2與高度近視脈絡(luò)膜新生血管形成密切相關(guān)[32]。

除脈絡(luò)膜新生血管以外，糖尿病視網(wǎng)膜病變也與MMP-2的異常表達(dá)相關(guān)。2007年Brahim Chaqour團(tuán)隊(duì)將高血糖致視網(wǎng)膜病變的大鼠與對照組的大鼠眼睛取出，解剖視網(wǎng)膜，通過原位酶譜法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性較弱，MMP-2活性較低[33]。

6 MMP-2在眼科其他疾病組織中的表達(dá)

MMP-2 在正常組織中的異常表達(dá)與眼部組織異常密不可分。而眼科疾病如眼母細(xì)胞瘤、眼黑色素瘤、翼狀胬肉以及其他眼部新生物的發(fā)生發(fā)展，都與MMP-2 的表達(dá)有關(guān)[34-36]。

2011 年，龍華團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用免疫組織化學(xué)SP法和HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析檢測50例眼母細(xì)胞瘤組織中MMP-2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織切片中MMP-2陽性表達(dá)38例，占76%；有視神經(jīng)浸潤的腫瘤MMP-2的表達(dá)水平明顯高于無視神經(jīng)浸潤的腫瘤，處于眼外期的腫瘤MMP-2的表達(dá)水平明顯高于眼內(nèi)期和青光眼期的腫瘤，提示MMP-2的表達(dá)水平與腫瘤浸潤、發(fā)展有關(guān)系[34]。2017年，Wang團(tuán)隊(duì)通過原位雜交技術(shù)和免疫組化檢測6份正常脈絡(luò)膜組織和18份脈絡(luò)膜黑色素瘤組織MMP-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常脈絡(luò)膜組織相比，脈絡(luò)膜黑色素瘤組織中MMP-2 mRNA水平增加，同時(shí)，MMP-2的蛋白水平也較高，支持MMP-2的較高表達(dá)與脈絡(luò)膜黑色素瘤進(jìn)展呈正相關(guān)的觀點(diǎn)[35]。2009年，Yang團(tuán)隊(duì)采用RT-PCR和酶譜法，檢測5例正常結(jié)膜組織與15例翼狀胬肉組織和其培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞觀察MMP-2 mRNA的表達(dá)和活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉組織和成纖維細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)高于正常組織和成纖維細(xì)胞，且與翼狀胬肉的進(jìn)展程度密切相關(guān)[36]。

7 MMP-2的作用機(jī)制

MMPs能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）成分，參與分解多種細(xì)胞外基質(zhì)和降解基底膜的生理和病理過程[37]。其中MMP-2主要在組織重塑、傷口愈合、血管生成和炎癥等方面起著重要作用[3]。MMP-2 的檢測技術(shù)已經(jīng)十分成熟，在疾病組織中的表達(dá)表現(xiàn)出了顯著的異常，但MMP-2在疾病發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚未明確。

在機(jī)體遭遇創(chuàng)傷時(shí)，大量炎性細(xì)胞聚集，釋放以TNF-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6（Interleukin-6，IL-6）為主的早期炎性介質(zhì)，啟動(dòng)全身炎性反應(yīng)。增高的TNF-α和IL-6等炎性介質(zhì)能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)，而過表達(dá)的MMP-2正是導(dǎo)致疾病的原因。在角膜疾病中，IL-6介導(dǎo)的MMP-2顯著上調(diào)，致使組織不斷壞死被降解，導(dǎo)致疾病發(fā)生[38]；在眼腫瘤中，這一系列炎癥反應(yīng)也有重要作用，過表達(dá)的MMP-2降解ECM，ECM的降解形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，直接導(dǎo)致了腫瘤轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)，因此在侵襲性強(qiáng)的腫瘤中，MMP-2往往呈現(xiàn)高表達(dá)[39]。

蛋白質(zhì)直接執(zhí)行生物功能，其表達(dá)與濃度也直接關(guān)系著生理及病理過程的發(fā)展。在近視的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)MMP-2 在眼組織中的濃度直接影響了鞏膜重塑，與疾病發(fā)展有密切關(guān)系。多項(xiàng)形覺剝奪導(dǎo)致近視的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，在鞏膜組織中存在MMP-2的酶原形式，而形覺剝奪這個(gè)過程打破了原有的酶原活化平衡，MMP-2的活化形式在鞏膜赤道部及后極部的濃度明顯升高，導(dǎo)致ECM大量降解，最終使后極部纖維層變薄，眼球前后徑方向拉伸[40-42]。mRNA水平也充分說明了這一過程，在形覺剝奪的過程中，MMP-2的mRNA表達(dá)上升[43，44]。在負(fù)透鏡誘導(dǎo)的近視模型的研究中[45]，也發(fā)現(xiàn)了相同的變化過程。這是MMP-2在近視形成過程中的變化。而在角膜疾病、后發(fā)性白內(nèi)障以及其他疾病中，MMP-2的酶原活化平衡被打破，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生也是目前研究的主要機(jī)制之一[24，46]。

總之，MMP-2 作為MMPs家族中的第二個(gè)成員，在眼部正常的生理過程和異常的病理生理過程都有著不可或缺的作用。MMP-2在眼內(nèi)檢測的技術(shù)也較為成熟。但MMP-2在疾病過程中的具體機(jī)制與信號通路尚不明確，是今后研究的重要方向。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔣潤：參與選題、設(shè)計(jì)；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。周激波：參與選題、設(shè)計(jì)；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修