千慧燕，閔鵬飛，楊冰祎，賈立軍*，劉德志

1.延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太鎮(zhèn)畜牧服務(wù)站，吉林磐石132307

乳酸菌(LAB)是一類能夠利用糖類進行代謝的革蘭氏陽性細菌，其生存范圍從土壤、植物覆蓋到哺乳動物的口腔、胃腸道等[1]。經(jīng)研究證明，乳酸菌的活用對動物健康有密切關(guān)系。乳酸菌不僅能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡、控制內(nèi)毒素、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖，同時，乳酸菌通過發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸、特殊酶系、胞外多糖、細菌素等營養(yǎng)物質(zhì)，可刺激組織發(fā)育，從而對動物的營養(yǎng)狀態(tài)、免疫反應(yīng)等產(chǎn)生促進作用。并且，絕大多數(shù)乳酸菌具有抗菌活性，主要是源于其生長代謝過程中所分泌的一系列活性物質(zhì)，諸如乳酸、胞外多糖、抗菌肽以及細菌素等[2]。所以乳酸菌具有非常良好的抗菌活性，同時也是其益生活力的重要指標之一。正常情況下的乳酸菌，活力極弱，這些益生菌只能在受到一定限制的環(huán)境中生存，一旦脫離生存條件，其自身就會遭到滅亡。所以只有經(jīng)過特殊工藝保護的乳酸菌才能到達腸道。進入體內(nèi)的乳酸菌，必須具有數(shù)量多、活力強，才能充分發(fā)揮生物功效。如何研制出高濃度且活力強的乳酸菌，成為了當今微生學家們追求的目標。

微量元素復(fù)合劑是經(jīng)過加工和調(diào)節(jié)的礦物質(zhì)，含有大量的微量元素。礦物來自自然界，是自然界中經(jīng)過長時間的惡劣天氣自然形成的巖石，以不同大小的顆粒形式存在于自然界中。由于乳酸菌的培養(yǎng)條件較好，而且對其生長和繁殖所需的微量元素的研究正在進行中，因此對有機微元素的研究很多，但過程成本較高，關(guān)于天然礦物微量元素的研究更少。本試驗中使用了天然礦物質(zhì)來優(yōu)化營養(yǎng)條件和影響的觀察來研究起初對乳酸菌的生長和繁殖、酸和堿的變化、細菌代謝物的溫度和抗菌的效果。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均從中科院微生物研究所購置，并在延邊大學農(nóng)學院微生物與免疫試驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基本實驗室配制。

1.3 乳酸菌的培養(yǎng)

將獲得的嗜酸乳桿菌材料與生理鹽水配置成懸濁液，再用劃線法接種到MRS瓊脂平板上，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用接種環(huán)從平板培養(yǎng)物上挑取某一單獨菌落，移種至MRS液體試管中，配置5組，再挑出4組加入乳酸菌培養(yǎng)中所需的常量元素，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌原液稀釋至106cfu/mL，倒入平皿中，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。

1.4 微量元素復(fù)合劑濃度對乳酸菌活性的影響

以濃度梯度法，將復(fù)合劑分別加入到含有常量元素的4組MRS液體試管中。設(shè)置復(fù)合劑濃度梯度分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%。不含復(fù)合劑和常量元素的MRS液體試管設(shè)為空白對照組。先高壓滅菌備用，再取乳酸菌懸液100 μL, 分別接種到MRS液體梯度試管中混勻,置37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。使用平板計數(shù)法，采取MRS培養(yǎng)液接種到平板中培養(yǎng)，觀察乳酸菌活性的濃度變化。

1.5 微量元素復(fù)合劑濃度對乳酸菌數(shù)量的影響

配合使用平板計數(shù)法：分別從取嗜酸乳菌MRS培養(yǎng)液樣品中搖勻取樣，在無菌環(huán)境下，用平板劃線法接種到普通瓊脂平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄平板培養(yǎng)基上菌落的數(shù)量。

1.6 微量元素復(fù)合劑濃度對乳酸菌形態(tài)的影響

采取MRS培養(yǎng)液，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑1 cm左右的涂膜。使用革蘭氏染色劑依次進行革蘭氏染色，最后用高清晰顯微鏡觀察活菌形態(tài)。

1.7 微量元素復(fù)合劑對乳酸菌菌液渾濁度變化的影響

取5 mL的菌液置于10 mL離心管中，經(jīng)4 000 r/min，離心20 min。棄去上清液，用生理鹽水洗滌。洗滌兩次后，用紫外分光光度計在波長600 nm范圍，測定該菌的吸光值，結(jié)合記錄的數(shù)據(jù)分析比較乳酸菌活性變化。

1.8 微量元素復(fù)合劑對乳酸菌抑菌效果的影響

取制備大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌層的平皿和離心后的上清液，使用牛津杯法，用抑菌圈用尺測量抑菌圈大小。測試6種乳酸菌的代謝產(chǎn)物針對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌的抑菌效果，分別測抑菌圈直徑，取平均值，分析礦粉對嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 細菌形態(tài)學觀察

經(jīng)高清晰顯微鏡觀察，細菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察可見細菌生長良好，菌落呈表面光滑不透明的圓形乳白色白蠟狀菌落，直徑約4～6 mm。

2.2 微量元素復(fù)合劑濃度對乳酸菌活性的影響

實驗結(jié)果表明，與空白對照組(即0%)對比,微量元素復(fù)合劑對乳酸菌的生長有促進作用。每一組加入復(fù)合劑的實驗組乳酸菌數(shù)量都要比空白組多，并且和空白對照組相比活菌數(shù)量幅度穩(wěn)定，死亡速度非常緩慢，仍然保持活性，當復(fù)合劑的濃度達到0.10%時，乳酸菌的增殖菌數(shù)最多，細菌最多數(shù)量為3.56×108，乳酸菌數(shù)量比較空白對照組多了0.8%。由此可見，濃度0.1%的微量元素復(fù)合劑最為適宜。

2.3 微量元素復(fù)合劑對細菌抑菌作用的影響

在金黃色葡萄球菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)中可知，微量元素復(fù)合劑濃度為0.05%和0.1%的抑菌圈直徑與空白對照組的抑菌圈直徑接近，其中濃度0.05%的乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌作用大于空白組。微量元素復(fù)合劑濃度0.1%的乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌作用和空白對照組相似，濃度0.05%的乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌作用均大于空白對照組。

在大腸肝菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)中可知，第一次乳酸菌抑菌圈直徑中每一組濃度均比空白對照組大，在第二次測量中每一組抑菌圈直徑都在10 mm左右。微量元素復(fù)合劑濃度0.05%和0.1%的乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌圈直徑平均數(shù)值比空白對照組大，濃度0.1%的乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌作用均大于空白對照組。

3 討論

微量元素作為微生物生長所必需，是構(gòu)成細菌菌體的重要組成成分，主要起到調(diào)節(jié)微生物生長滲透壓，維持增殖過程中所需酶的活性等作用。在地殼中自然存在的微量礦物質(zhì)元素，作為生物成長中的營養(yǎng)元素，對身體維持生命起著重要作用。礦物質(zhì)、微量元素為乳酸菌的生長和繁殖提供了必要的營養(yǎng)。乳酸菌是腸道菌群的主要組成部分，其代謝產(chǎn)物如細菌素可抑制腸道細菌中受損細菌的生長和繁殖，并對維持腸道微生物的平衡起著重要作用。代謝物乳酸細菌培養(yǎng)測試后的24 h內(nèi),結(jié)果表明,礦物質(zhì)微量元素可以更好地改善代謝產(chǎn)物乳酸細菌的抗菌食品工業(yè)中,能夠抑制有害細菌的生長和繁殖的食品,延長壽命。

本實驗中，通過對實驗結(jié)果的分析,適當濃度(即0.1 g/mL)的微量元素可以促進乳酸菌的生長和繁殖,延長其存活時間,并提高乳酸菌的抑菌效果在其他細菌和抑菌作用的持續(xù)時間增加。