袁 亮，高炟鵬，嵇 晴

0 引 言

膿毒癥患者出院后會(huì)出現(xiàn)不同程度的遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙及心理缺陷[1-2]；且早期炎癥反應(yīng)會(huì)增加未來(lái)患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。但機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)如同位素標(biāo)記相對(duì)或絕對(duì)定量(iTRAQ)的發(fā)展極大地提高了疾病的檢測(cè)能力，現(xiàn)已廣泛用于探索各種疾病的分子標(biāo)記和機(jī)制[4]。盡管目前通過(guò)對(duì)單個(gè)基因或蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)揭示了炎癥引發(fā)神經(jīng)行為異常的各種機(jī)制，但尚缺乏對(duì)海馬蛋白組學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)分析。因此，本研究旨在探討LPS暴露后導(dǎo)致的遠(yuǎn)期神經(jīng)行為改變及其機(jī)制，為炎癥致遠(yuǎn)期認(rèn)知功能損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取雄性C57BL/6小鼠90只3～4月齡，體重29～35 g，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(軍)2017-0037]，飼養(yǎng)于濕度50%，溫度25 ℃，12 h燈照的環(huán)境中，自由攝水，飲食。所有小鼠隨機(jī)分為：等滲鹽水組(對(duì)照組，n=20)、LPS組(LPS組，n=40)與LPS + Roscovitine(LPS+R組，n=40)。對(duì)照組小鼠腹腔注射等滲鹽水(10 mL/kg)；LPS組小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)；LPS+R組腹腔注射LPS(5 mg/kg)。所有小鼠注射完成后飼養(yǎng)12個(gè)月。對(duì)照組和LPS組在行為學(xué)檢測(cè)完成后，取海馬組織，采用iTRAQ技術(shù)尋找發(fā)揮重要作用的蛋白靶點(diǎn)。在行為學(xué)檢測(cè)前3 d開(kāi)始直至行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束當(dāng)天，LPS+R組每天腹腔注射Roscovitine(20 mg/kg)；對(duì)照組和LPS組每天腹腔注射等量等滲鹽水。

1.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)功能力和焦慮樣行為。實(shí)驗(yàn)在安靜的環(huán)境中進(jìn)行，將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱(50 cm × 50 cm × 40 cm)中自由探索5 min并進(jìn)行攝像。記錄其探索運(yùn)動(dòng)總路程以及在中央格停留的時(shí)間。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以75%乙醇棉球擦拭場(chǎng)地以免氣味干擾。

1.3糖水消耗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前，安靜房間內(nèi)訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)糖水。每籠同時(shí)放置2枚水瓶均裝有1%蔗糖水，放置24 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)給予每只小鼠事先定量的1%蔗糖水和純水，12 h后交換2枚水瓶位置，24 h后稱重，計(jì)算動(dòng)物的糖水消耗比例(糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.4條件性恐懼實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和測(cè)試2部分。將小鼠放入測(cè)試箱(32 cm × 25 cm × 25 cm)自由探索180 s，接著給予30 s聲音刺激(65 dB，1000 Hz)，在聲音刺激的最后2 s予電刺激(0.8 mA)，再記錄30 s的僵直行為。場(chǎng)景性條件恐懼測(cè)試在訓(xùn)練后24 h進(jìn)行.將小鼠置于原實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，不予聲音刺激和電刺激，監(jiān)測(cè)5 min內(nèi)的僵直行為；2 h后開(kāi)始聲音條件性測(cè)試，先在新環(huán)境中適應(yīng)180 s，再給予180 s相同的聲音刺激并監(jiān)測(cè)僵直行為。記錄小鼠場(chǎng)景性僵直時(shí)間和條件性僵直時(shí)間。

1.5強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)在透明玻璃缸(直徑15 cm、高度30 cm)中加滿水(20～24 ℃)。將小鼠放入水中游泳6 min，觀察4 min內(nèi)小鼠靜止不動(dòng)行為累計(jì)時(shí)間(s)。靜止不動(dòng)行為指大鼠除了為避免沒(méi)入水中而向上的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)外，無(wú)其他行為。

1.6蛋白質(zhì)組學(xué)行為學(xué)檢測(cè)完成后，每組隨機(jī)抽取6只小鼠，腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后處死，快速收集小鼠海馬組織。用磷酸緩沖鹽水沖洗，在液氮中冷凍。提取和溶解組織后，使用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex試劑盒標(biāo)記胰蛋白酶肽。對(duì)照組使用iTRAQ tags 113和114進(jìn)行標(biāo)記，LPS組使用tags 115和116進(jìn)行標(biāo)記。用Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記和串聯(lián)質(zhì)譜分析[4-5]。

1.7Western blot檢測(cè)每組取4只小鼠海馬組織，加裂解緩沖液，冰上裂解，4 ℃離心，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸 5 min 變性，經(jīng) SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。用5%脫脂乳在Tris緩沖液中封閉2 h后，之后加anti-SynGAP1(1∶500; APExBIO)、Anti-phospho-SynGAP (1∶500; bs-10392R), and GAPDH (1∶5000; Sigma St. Louis) 4 ℃過(guò)夜。充分洗膜后，加HRP結(jié)合二抗(1∶5000; Santa Cruz Biotechnology)室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL) 顯影后，用Image J軟件(NIH Image, Bethesda)分析灰度值，對(duì)海馬SynGAP1和pSynGAP1進(jìn)行可視化和定量分析。

1.8CA1區(qū)局部場(chǎng)電位記錄每組取5只小鼠使用2%戊巴比妥鹽溶液(40 mg/kg，Sigma)腹腔注射麻醉后，將其頭部固定在立體定位儀上實(shí)施手術(shù)，整個(gè)手術(shù)過(guò)程中使用體溫維持儀將小鼠體溫維持34～36 ℃。在小鼠海馬CA1區(qū)(前囟后2.1 mm、旁開(kāi)1.5 mm、深度1.5 mm)處置入8通道的微電極裝置。所有電極均連接于微型連接器，并用牙科丙烯酸材料固定在顱骨上。術(shù)后經(jīng)歷7 d恢復(fù)期后將小鼠放入曠場(chǎng)中自由探索同時(shí)記錄局部場(chǎng)電位，記錄3 min。所有的數(shù)據(jù)均是通過(guò)Neuroexplorer(Plexon Inc., Dallas, TX)軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組和LPS組小鼠死亡率比較對(duì)照組無(wú)小鼠死亡，LPS組小鼠存活率為62.5%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2兩組差異性蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示Syngap1處于蛋白質(zhì)之間相互作用中心，見(jiàn)圖2。

2.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，LPS對(duì)運(yùn)動(dòng)總距離與中央格停留時(shí)間無(wú)影響(P>0.05)。條件相關(guān)恐懼實(shí)驗(yàn)中， 與對(duì)照組相比，LPS組小鼠場(chǎng)景相關(guān)僵直時(shí)間顯著下降(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+R組小鼠僵直時(shí)間顯著增加(P<0.05)。聽(tīng)覺(jué)相關(guān)的恐懼實(shí)驗(yàn)中，各組間的聲音相關(guān)僵直時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+R組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.05)。糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠對(duì)糖水的偏好度顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+R組小鼠對(duì)糖水的偏好度顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4海馬組織Syngap1和pSyngap1的表達(dá)水平變化與對(duì)照組比較，LPS組海馬組織中Syngap1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而pSyngap1的表達(dá)顯著降低(P< 0.05)，見(jiàn)圖3。

圖 1 LPS對(duì)存活率的影響

圖 2 兩組差異性蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表 1 各組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.5海馬pCamkII、pSynGAP1表達(dá)變化的比較與對(duì)照組比較，LPS組海馬組織中pCamkII及pSynGAP1顯著降低(P<0.05)，而Roscovitine可逆轉(zhuǎn)pCamkII及pSynGAP1顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.6在體海馬CA1區(qū)神經(jīng)振蕩的比較與對(duì)照組比較，LPS組小鼠海馬CA1區(qū)theta與gamma振蕩顯著降低，而Roscovitine可逆轉(zhuǎn)theta與gamma振蕩顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與LPS組比較，#P<0.05

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3 討 論

全身炎癥可介導(dǎo)遠(yuǎn)期認(rèn)知功能損傷，但機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，LPS暴露后遠(yuǎn)期神經(jīng)行為出現(xiàn)異常，且pSynGAP1的表達(dá)異?？赡苁墙閷?dǎo)LPS暴露后海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)失衡及遠(yuǎn)期神經(jīng)行為異常的重要原因。

臨床研究發(fā)現(xiàn)：重癥監(jiān)護(hù)病房中膿毒癥患者會(huì)表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙[1]。最近的流行病學(xué)研究報(bào)告顯示，膿毒癥存活患者發(fā)生遠(yuǎn)期認(rèn)知能力下降的風(fēng)險(xiǎn)增加[6]。其中病理性特征改變包括神經(jīng)炎癥、突觸丟失和腦萎縮[7-8]。在膿毒癥動(dòng)物模型中(腹腔注射LPS或盲腸結(jié)扎和穿刺)，發(fā)現(xiàn)淀粉樣前體蛋白和淀粉樣β蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)積累，繼而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[3]。利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法深入詮釋各種細(xì)胞內(nèi)的生理過(guò)程，以及疾病如何影響這些過(guò)程，從而識(shí)別出新的生物標(biāo)志物[4]。特別是基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，可全面了解蛋白質(zhì)組學(xué)和數(shù)萬(wàn)個(gè)磷酸化變化[9]。本研究LPS暴露后凋亡、線粒體功能障礙和微管相關(guān)蛋白相關(guān)的多個(gè)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在LPS暴露后顯著上調(diào)，其中包括Cdk11b、Atp8a1、Iscu、Map1b、Dctn1、Map2和Ank2磷酸化增加。這些結(jié)果與之前的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)的相一致，即細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙和微管相關(guān)蛋白的紊亂會(huì)破壞海馬的學(xué)習(xí)記憶功能[10-11]。此外，LPS暴露的小鼠中有一些突觸相關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，如Syngap1、Bsn、Shisa6、Synpo、Pclo、Ppp1r9b和Dlgap2等，突觸功能障礙也被廣泛認(rèn)為是AD病程中最早發(fā)生的神經(jīng)退行性病變[8]。

根據(jù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SynGAP1處于突觸可塑性改變的中心位置。SynGAP大多分布在谷氨酸能神經(jīng)元的突觸后間隙，通過(guò)結(jié)合突觸中AMPA受體來(lái)調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度[12]。SynGAP與突觸后支架蛋白結(jié)構(gòu)相似，突觸后支架蛋白是維持突觸密度、突觸生理功能和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的重要因素。SynGAP障礙與許多神經(jīng)精神疾病有關(guān)，如智力殘疾、自閉癥等[13]。已有研究證明，形成長(zhǎng)期記憶的過(guò)程中，PSynGAP1對(duì)于AMPA受體結(jié)合和樹(shù)突棘生長(zhǎng)是必不可少的，而CaMKII抑制劑可抑制SynGAP擴(kuò)散從而防止突觸發(fā)生長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，即pSynGAP1受CaMKII調(diào)控，從而影響突觸可塑性[14]。本實(shí)驗(yàn)中使用Cdk5抑制劑Roscovitine上調(diào)pSynGAP1水平，改善認(rèn)知障礙。同時(shí)，本研究表明Roscovitine能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的海馬突觸喪失。大腦功能都是基于特定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩完整性，其中，θ振蕩參與各種認(rèn)知過(guò)程，尤其是海馬相關(guān)的記憶過(guò)程，而γ振蕩與感覺(jué)、學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS暴露的動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中θ和γ振蕩明顯降低，但Roscovitine可以逆轉(zhuǎn)LPS引起的海馬振蕩障礙和神經(jīng)行為異常，說(shuō)明海馬神經(jīng)振蕩網(wǎng)絡(luò)完整性需要pSynGAP1參與。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)pSynGAP1介導(dǎo)的海馬振蕩網(wǎng)絡(luò)紊亂在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)行為異常中發(fā)揮關(guān)鍵重要作用，提示pSynGAP1可作為全身炎癥相關(guān)性疾病潛在治療靶點(diǎn)。