秦青秀,葉麗虹

聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院超聲科，福建漳州363000

甲狀腺結(jié)節(jié)是目前最常見(jiàn)的甲狀腺疾病，其多見(jiàn)于女性，且患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而逐步升高[1]。由于甲狀腺結(jié)節(jié)具有良性和惡性之分。因此針對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行早期診斷，對(duì)于臨床治療策略的制定和實(shí)施非常關(guān)鍵。目前超聲檢查已廣泛用于甲狀腺結(jié)節(jié)疾病的檢測(cè)和評(píng)估，然而普通二維超聲在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的診斷上具有較大的局限性[2]。超聲彈性成像是Ophir博士于1991年首先提出的。該技術(shù)基于不同組織的彈性系數(shù)不同，通過(guò)超聲探測(cè)實(shí)體腫塊的硬度，并同正常組織進(jìn)行對(duì)比來(lái)鑒別其良惡性來(lái)達(dá)到診斷目的[3]。microRNA(miRNA)為一類(lèi)廣泛存在于真核細(xì)胞中的非編碼單鏈小RNA分子。目前已有大量研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)的miRNA，且通過(guò)對(duì)這些腫瘤特異性miRNA的檢測(cè)將極大地有助于對(duì)腫瘤性質(zhì)的診斷[4-5]。miR-21是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與腫瘤相關(guān)的miRNA分子，有研究證實(shí)[6]miR-21的高表達(dá)與甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。該次研究通過(guò)超聲彈性成像技術(shù)聯(lián)合血清miR-21對(duì)2016年1月—2018年12月該院收治的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行檢測(cè)，探討其在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇該院收治的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者作為研究對(duì)象。患者年齡27～53歲，平均年齡(32.7±6.5)歲；其中男性68例，女性112例。180例患者甲狀腺結(jié)節(jié)直徑0.4～5.2 cm，平均(0.86±0.42)cm。另選擇30名健康體檢者作為健康對(duì)照組。①所有受試對(duì)象術(shù)前均未進(jìn)行針對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的治療；②均排除合并腦、肺、肝、腎嚴(yán)重疾?。虎劬懦喜⑵渌麗盒阅[瘤；④均排除嚴(yán)重急慢性感染性疾病。該研究術(shù)前均征得患者及家屬的知情同意并簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 超聲彈性成像

①儀器：采用TOSHIBA公司的Acuson S2000彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢測(cè)。超聲診斷儀器規(guī)格為線陣9L4探頭，探頭頻率4～9 MHz，具備常規(guī)超聲和彈性成像功能。②檢查操作：患者平躺仰臥于檢測(cè)床上，充分暴露檢測(cè)頸部區(qū)域。先進(jìn)行常規(guī)二維超聲檢查，對(duì)甲狀腺橫切面和縱切面進(jìn)行連續(xù)超聲掃描，觀察和記錄結(jié)節(jié)的部位、大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲、有無(wú)鈣化、結(jié)節(jié)周邊及內(nèi)部彩色血流分布情況。根據(jù)常規(guī)二維超聲確認(rèn)目標(biāo)病灶后進(jìn)行實(shí)時(shí)組織彈性成像檢測(cè)。設(shè)置超聲彈性成像取樣框，面積大小為病灶區(qū)域的2～3倍。取樣框范圍應(yīng)包括病灶結(jié)節(jié)、結(jié)節(jié)周?chē)谞钕俳M織及其前方的胸鎖乳頭肌。將超聲探頭垂直置于體表病灶區(qū)，然后進(jìn)行輕按壓—解除按壓操作，待圖像穩(wěn)定后采集彈性圖像并存貯。③病灶彈性成像硬度評(píng)分：采用5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：整體病灶區(qū)或著大部分病灶區(qū)顯示呈均勻綠色(1分)；病灶中心區(qū)顯示呈藍(lán)色，周邊區(qū)域顯示呈綠色(2分)；病灶區(qū)顯示呈現(xiàn)雜亂的藍(lán)綠相間分布，綠色和藍(lán)色所占比例相近(3分)；整體病灶區(qū)呈藍(lán)色或病灶區(qū)內(nèi)伴有少許綠色(4分)；整個(gè)病灶及周邊組織區(qū)域均顯示呈藍(lán)色(5分)。評(píng)分1～3分者為良性，；4～5分者則診斷為惡性。所有患者均由一名具有10年以上超聲臨床診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行超聲彈性成像和彈性評(píng)分。

1.3 血清miR-21檢測(cè)

①血清樣本采集。所有受試者均凌晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，置于4℃，3 000 rpm/min條件下離心15 min，抽取上層血清置于新的EP管，集中統(tǒng)一編號(hào)后置于-80℃冰箱待下一步實(shí)驗(yàn)。②血清總RNA提取。采用Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)對(duì)提取血清總RNA。經(jīng)過(guò)RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后。RNA電泳檢測(cè)提取RNA分子的完整性，NanodropRND-1000測(cè)定提取RNA的濃度。③逆轉(zhuǎn)錄(RT)。采用miScript Reverse Transcription Kit(天根生化科技有限公司)構(gòu)建10μL反應(yīng)體系：RNA 3μL，1×mirVana RT Primer 1μL，Array script Enzyme Mix 0.4μL，mirVana RT Buffer(5×)2μL，加RNase-free water至總體積10μL。反應(yīng)條件：16℃，30 min；42℃，30 min；84℃，5 min。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：按照miRNA SYBR Green PCR Kit(天根生化科技有限公司)操作步驟構(gòu)建20μL反應(yīng)體系：1×cDNA模板1～2.5μL，5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4μL，PCRForward Primer(20×)1 μL，PCR Reverse Primer(20×)1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，加入Nuclease-free H2O至總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃變性15 s；60℃退火1 min，共45個(gè)PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析miR-21表達(dá)的相對(duì)定量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

納入研究的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者術(shù)后病理檢測(cè)證實(shí)良性結(jié)節(jié)96例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫69例、甲狀腺腺瘤20例、橋本甲狀腺炎7例；甲狀腺癌84例，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)72例，濾泡狀甲狀腺癌(FTC)8例，甲狀腺髓樣癌(MTC)4例。

2.2 超聲彈性評(píng)分

良性結(jié)節(jié)組超聲彈性評(píng)分明顯低于甲狀腺癌組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.847,P＜0.05)。超聲彈性評(píng)分1～3分的結(jié)節(jié)患者有94例，其中12例為惡性，82例為良性；4～5分者有86例，其中72例為惡性，14例為良性。見(jiàn)表1。

表1 超聲彈性評(píng)分與病理診斷結(jié)果比較[(±s)，分]

表1 超聲彈性評(píng)分與病理診斷結(jié)果比較[(±s)，分]

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2.3 血清miR-21檢測(cè)結(jié)果比較

良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平為(0.73±0.21)，甲狀腺癌組患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平為(1.78±0.43)，甲狀腺癌組患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者(t=5.273,P＜0.05)。健康對(duì)照組人群血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平為(0.49±0.13)，明顯低于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.549,P＜0.05)，和甲狀腺癌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.476,P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組血清miR-21表達(dá)

2.4 超聲彈性成像和血清miR-21水平對(duì)甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果，超聲彈性成像診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的受試者工作特性曲線(ROC)下AUC為0.729，血清miR-21水平的ROC曲線下AUC為0.771，而聯(lián)合超聲彈性成像和血清miR-21診斷的ROC曲線下AUC為0.868，明顯高于超聲彈性成像(Z=3.477,P＜0.05)和血清miR-21(Z=3.762,P＜0.05)單個(gè)指標(biāo)對(duì)甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值，見(jiàn)圖2。

3 討論

普通二維超聲是目前臨床上首選的甲狀腺病灶的檢測(cè)技術(shù)。由于甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病存在的多源性，其病理類(lèi)型比較復(fù)雜；因而良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)在二維超聲檢測(cè)聲像圖上的表現(xiàn)也呈多樣性，且常有重疊交叉，因此普通二維超聲在對(duì)甲狀腺病灶良惡性的診斷效能上尚存在較大的局限性。有研究顯示[7]，普通二維超聲對(duì)甲狀腺癌的診斷準(zhǔn)確性僅在50%左右。

超聲彈性成像技術(shù)檢測(cè)腫瘤的基本原理是利用腫瘤組織與周?chē)＝M織之間存在的彈性系數(shù)的差異，通過(guò)超聲探頭對(duì)檢查腫塊組織施加壓力后，根據(jù)相應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)變大小的不同，從而間接或直接反映被檢查腫塊組織內(nèi)部的彈性大小，從而推斷腫塊組織的良惡性性[8]。目前臨床上超聲彈性成像檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于乳腺、甲狀腺和淋巴結(jié)等表淺部位組織病變的診斷[9-10]。Lv等[11]采用內(nèi)鏡超聲實(shí)時(shí)組織彈性成像檢測(cè)42例消化系統(tǒng)實(shí)體瘤，結(jié)果顯示其診斷消化系統(tǒng)惡性腫瘤的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為91.4%、88.9%和87.5%，AUC值為0.80。提示內(nèi)鏡超聲實(shí)時(shí)組織彈性成像能有效地鑒別消化道腫瘤的良惡性，提高診斷準(zhǔn)確率，是鑒別診斷消化道腫瘤的有效方法。Kyriakidou等[12]采用超聲組織彈性成像技術(shù)分析62例甲狀腺結(jié)節(jié)患者(84個(gè)結(jié)節(jié)中良性73個(gè)，惡性11個(gè))。其對(duì)甲狀腺癌診斷的敏感性為73%，特異性為70%，陰性預(yù)測(cè)值為94%，診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的AUC值為0.71；較普通二維超聲更有助于對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行診斷篩查。該研究采用超聲組織彈性成像技術(shù)對(duì)180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行檢測(cè)分析，并以病理檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，甲狀腺良性結(jié)節(jié)組超聲彈性評(píng)分明顯低于甲狀腺癌組，即甲狀腺癌組織的硬度要顯著高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)。AUC值是反映ROC曲線診斷試驗(yàn)的敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，AUC值越高，其診斷價(jià)值也越高。通過(guò)構(gòu)建ROC曲線，超聲組織彈性成像診斷甲狀腺腫塊良惡性的AUC值為0.795，提示超聲彈性成像對(duì)甲狀腺癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。然而，通過(guò)超聲彈性成像技術(shù)在診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性上尚存在一定的誤診率。研究中超聲彈性評(píng)分1～3分的結(jié)節(jié)中有12例為惡性，4～5分者則有14例為良性，因此存在一定假陽(yáng)性和假陰性情況。分析其誤診的原因可能在于[13-14]：①甲狀腺良性腫瘤發(fā)生纖維化和鈣化引起甲狀腺組織硬度增大；②甲狀腺惡性腫瘤病灶很??；或者發(fā)生液化壞死導(dǎo)致其組織硬度減??；③操作過(guò)程中操作者施力度的大小、振動(dòng)頻率等主觀因素的影響。以上因素都能對(duì)成像效果造成干擾，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。

圖2 超聲彈性成像和血清miR-21診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的ROC曲線

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼的短鏈小RNA分子。研究證實(shí)[15-16]，miRNA在人血液循環(huán)中穩(wěn)定表達(dá)，且具有生物遺傳和種屬表達(dá)保守性的特點(diǎn)。因此，miRNA具有成為新的疾病監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的潛能。miR-21是目前已知的具有癌基因特性的miRNA。趙等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者腫瘤組織和血清中miR-21的表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)水平與甲狀腺癌的臨床病理特征有關(guān)，因而miR-21檢測(cè)對(duì)甲狀腺癌的診斷和判斷預(yù)后上存在較高的臨床價(jià)值。該研究中，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示miR-21在甲狀腺癌組患者血清中的相對(duì)表達(dá)水平要明顯高于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者和健康對(duì)照組。ROC曲線結(jié)果顯示血清miR-21水平的ROC曲線下AUC為0.814。提示血清miR-21對(duì)于臨床輔助診斷甲狀腺癌具有積極的參考價(jià)值。然而，由于miR-21并非在甲狀腺癌組織中特異性表達(dá)，惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌等惡性腫瘤也會(huì)導(dǎo)致患者血清中miR-21的表達(dá)增高[18]。因此在特異性尚不夠高，尚需要聯(lián)合檢測(cè)來(lái)彌補(bǔ)。進(jìn)一步，該研究將超聲彈性成像和血清miR-21聯(lián)合起來(lái)對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行評(píng)估診斷。結(jié)果顯示兩者聯(lián)合診斷甲狀腺癌的ROC曲線下AUC為0.868，明顯高于單個(gè)指標(biāo)對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值。提示超聲彈性成像技術(shù)聯(lián)合血清miR-21檢測(cè)有助于對(duì)甲狀腺癌的早期鑒別和診斷。

綜上所述，彈性成像和血清miR-21聯(lián)合檢測(cè)能夠從不同角度對(duì)甲狀腺癌患者提供較為準(zhǔn)確診斷，二者能夠互補(bǔ)，減少誤診。但尚需開(kāi)展大樣本量的多中心的進(jìn)一步研究和臨床論證。進(jìn)而為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別提供了更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的診斷方法。