邊 芳，李 寧，李 奇，李 康，金 雯

(1.陜西省友誼醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 陜西 西安 710068; 西安交通大學第一附屬醫(yī)院 2.神經(jīng)外科;3.腫瘤外科, 陜西 西安 710061; 4.陜西省人民醫(yī)院 婦科, 陜西 西安 710068)

1型糖尿病(type 1 diabetes, T1D)是一種多發(fā)生在兒童和青少年的自身免疫性疾病[1]。與糖尿病有關的微血管并發(fā)癥可嚴重影響患者的預后[2]。1型糖尿病腎病(type 1 diabetic nephropathy, T1DN)占T1D所有死亡人數(shù)的21%，而包括糖尿病性心肌病在內(nèi)的心血管疾病占T1D所有死亡人數(shù)的44%[3]。上述兩種病理學特征都包括局部炎性反應、內(nèi)皮功能障礙、相關細胞存活途徑受損等[4]。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是多基因膜聯(lián)蛋白家族成員，具有抗感染和促分解活性[5]。ANXA1的表達水平在許多疾病中均發(fā)生改變[6]。其他研究者采用人重組ANXA1(human recombinant annexin A1, hrANXA1)或其N端肽(Ac2-26)治療多種疾病的實驗模型，均取得較好的治療效果[7-8]。然而，目前尚不清楚ANXA1在治療T1D中的潛在應用價值。因此，本研究旨在調(diào)查ANXA1在T1D患者中的表達水平，并考察ANXA1在T1D動物模型中對微血管并發(fā)癥(糖尿病性心肌病和糖尿病性腎病)的干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料：30位健康體檢者、30例T1D患者和30例T1DN患者。排除患有惡性腫瘤、嚴重心血管病等疾病病史、精神類疾病、具有溝通障礙、病例資料不全的患者。3組受試者男女各半。健康體檢者年齡為7～20歲，平均(16.2±4.6)歲；1型糖尿病患者年齡為7～21歲，平均(16.7±4.2)歲；T1DN患者年齡為8～24歲，平均(16.9±5.1)歲。3組受試者的性別和年齡無差異。檢測受試者的空腹血糖(FBG)水平。本研究已通過本院倫理委員會的審查(倫理審批號：SYY-SJW1810-005)，所有受試者或其監(jiān)護人均簽署研究知情同意書。

1.1.2 動物及試劑：SPF級10周齡野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠體質(zhì)量為22～27 g [陜西省人民醫(yī)院實驗動物中心(SYXK(陜)2016-006)]。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma Aldrich公司)；人重組ANXA1(hrANXA1)(武漢艾美捷科技有限公司)；胰島素、尿白蛋白和ANXA1 ELISA試劑盒、天狼星紅染色試劑盒、所有抗體(Abcam公司)；periodic-acid-schiffs (PAS)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；組織裂解緩沖液(Roche公司)；BCA試劑盒和超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 受試者血漿ANXA1和CRP水平的檢測：通過ELISA檢測受試者血漿ANXA1和C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)水平，檢測方法嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.2 動物的分組及處理：將小鼠隨機分為假手術組(sham組，靜脈注射等體積0.9 mol/L檸檬酸鹽緩沖液)、模型組(model組，靜脈注射100 mg/kg的鏈脲佐菌素溶液，STZ溶解在0.9 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，共注射5 d)、人重組ANXA1治療組(hrANXA1組，將hrANXA1加入到含有140 mmol/L 氯化鈉的混合液中，調(diào)節(jié)pH為7.4，hrANXA1為10 μg/mL。每只小鼠每天腹腔注射100 μL hrANXA1溶液(1 μg)，連續(xù)治療8周，每組10只。

1.2.3 口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test, OGTT)：在測試前小鼠禁食18 h，檢測小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)水平。然后灌胃葡萄糖溶液(1 g/kg)，分別在給藥前后每隔15 min通過尾靜脈穿刺測量血糖。

1.2.4 心臟功能的評估：給藥完成后將小鼠仰臥固定，使用小動物超聲成像系統(tǒng)Vevo770記錄胸骨旁短軸切面M型超聲心動圖圖像。獲取胸骨旁短軸切面M型超聲圖像。超聲測量指標包括EF和FS。

1.2.5 血液和尿液的生化分析：Au400全自動血液生物化學分析儀檢查血清尿素和肌酐水平。使用ELISA試劑盒測量血清胰島素和尿白蛋白水平。

1.2.6 ELISA檢測ANXA1含量：通過ELISA試劑盒測定小鼠血清、小鼠心臟和腎臟的蛋白裂解物中ANXA1的濃度。

1.2.7 組織學檢測腎臟：將腎臟在10%中性緩沖的甲醛中固定48 h，然后用梯度乙醇脫水。將組織包埋在石蠟中并切成4 μm厚的切片。然后用periodic-acid-schiffs (PAS)染色試劑盒或天狼星紅染色試劑盒對組織進行染色，染色方法嚴格按照生產(chǎn)商說明書進行。

1.2.8 Western blot檢測Akt、p38、JNK和ERK1/2蛋白：將小鼠心臟和腎臟組織加入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解。然后用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。在SDS-PAGE上分離樣品并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。將膜在4 ℃下與以下一抗過夜孵育：蛋白激酶B(Akt)/p-Akt Ser473、p38/p-p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p-JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)/p-ERK1/2 Thr202/Tyr204和GAPDH。然后將膜用PBST洗滌3次，將膜在室溫下與山羊抗兔二抗孵育1 h。通過超敏ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯影。GAPDH作為內(nèi)部對照并用于蛋白相對表達量的計算。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 T1D患者的血漿ANXA1和CRP水平

FBG與ANXA1和CRP的交互作用不顯著(P<0.05)。與健康體檢者相比，T1D患者血漿ANXA1的水平顯著降低，而空腹血糖(FBG)和CRP水平顯著升高(P<0.05)。并且，T1DN患者的血漿ANXA1水平顯著低于T1D患者，而FBG和CRP水平顯著高于T1D患者(P<0.05)(表1)。

表1 T1D患者的血漿ANXA1和CRP水平

2.2 模型小鼠的口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)AUC值和血清胰島素水平

FBG與OGTT AUC(F=159.341，P<0.001)和血清胰島素(F=347.941，P<0.001)的交互作用顯著。通過回歸分析對血糖進行校正后，與假手術組相比，模型組FBG和OGTT的AUC值顯著升高，而血清胰島素水平顯著降低(P<0.05)。hrANXA1治療組的FBG和OGTT的AUC值顯著降低，而血清胰島素水平顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠的OGTT AUC值和血清胰島素水平

2.3 模型小鼠的左室射血分數(shù)(ejection fraction, EF)和左室短軸縮短率(fraction shortening, FS)

FBG與EF(F=175.691，P<0.001)和FS(F=441.886，P<0.001)的交互作用顯著。通過回歸分析對血糖進行校正后，與假手術組相比，模型組的EF和FS值均顯著降低(P<0.05)。hrANXA1治療組的EF和FS值相較于模型組均顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 小鼠的EF和FS測量

2.4 模型小鼠的血清尿白蛋白與肌酐比值(ACR)和尿素水平

FBG與ACR(F=212.769，P<0.001)和尿素(F=41.466，P<0.001)的交互作用顯著。通過回歸分析對血糖進行校正后，與假手術組相比，模型組的血清尿白蛋白與肌酐的比值(ACR)和尿素水平均顯著升高(P<0.05)。hrANXA1治療組的血清ACR和尿素水平較模型組均顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 小鼠的血清ACR和尿素水平

2.5 模型小鼠的血清、心臟和腎臟ANXA1水平

FBG與血清ANXA1(F=1637.528，P<0.001)、心臟ANXA1(F=318.354，P<0.001)和腎臟ANXA1(F=112.144，P<0.001)的交互作用顯著。通過回歸分析對血糖進行校正后，與假手術組相比，模型組血清、心臟和腎臟中ANXA1水平均顯著降低。hrANXA1治療組的血清、心臟和腎臟ANXA1水平均顯著高于模型組(P<0.05)(表5)。

表5 小鼠的血清、心臟和腎臟ANXA1水平

2.6 模型小鼠腎臟組織學改變

模型組腎臟組織間隙和脈管系統(tǒng)周圍膠原蛋白顯著增加，模型組腎臟表現(xiàn)出近曲腎小管細胞擴張，近曲腎小管細胞的S1-S2區(qū)段血管變性程度明顯增加，腎小球擴大。而hrANXA1治療組的腎臟組織病理改變明顯減輕(P<0.05)(圖1)。

2.7 模型小鼠心臟和腎臟組織中Akt、p38、JNK和ERK1/2信號通路的活化情況

與假手術組相比，模型組心臟和腎臟組織中Akt磷酸化水平顯著降低，而MAPK的3個亞族(p38、JNK和ERK1/2)的磷酸化水平均顯著升高(P<0.05)(圖2)。與模型組比較，hrANXA1治療組的心臟和腎臟組織中Akt磷酸化水平顯著升高，而p38、JNK和ERK1/2的磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

3 討論

ANXA1參與調(diào)節(jié)許多細胞生命活動，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡和信號傳導等。近年來，發(fā)現(xiàn)ANXA1參與心臟病、腦梗死和動脈粥樣硬化等多種疾病。糖尿病及腎功能不全患者中ANXA1的表達水平降低，并且其可調(diào)節(jié)糖尿病腎病的進展。本研究發(fā)現(xiàn)ANXA1的表達水平在T1D患者中降低，并且伴有腎病患者的ANXA1水平更低。此外，T1D患者的血漿CRP升高。已知CRP升高與心肌梗死、卒中和冠心病的不良結局密切相關，并且CRP升高也是T1D患者病情惡化的常見標志。另外，T1D小鼠模型小鼠血清、心臟和腎臟中的ANXA1水平都降低，與T1D患者的變化一致。其他研究者發(fā)現(xiàn)外源性人重組ANXA1(hrANXA1)和Ac2-26肽(ANXA1的N端功能片段)在治療非酒精性脂肪性肝炎和動脈粥樣硬化中具有良好效果[7-8]。本研究中，小鼠經(jīng)過hrANXA1治療后，血清、心臟和腎臟ANXA1水平均顯著提高。

圖1 小鼠腎臟組織天狼星紅染色和PAS染色Fig 1 Sirius red staining and PAS staining of mouse kidney tissue

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group圖2 小鼠心臟中Akt、p38、JNK和ERK1/2信號通路的磷酸化情況Fig 2 Phosphorylation of Akt, p38, JNK and ERK1/2 signaling pathways in mouse heart n=10)

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group圖3 小鼠腎臟中Akt、p38、JNK和ERK1/2信號通路的磷酸化情況Fig 3 Phosphorylation of Akt, p38, JNK and ERK1/2 signaling pathways in mouse kidney n=10)

有學者發(fā)現(xiàn)外源性ANXA1預培養(yǎng)胰島可增強葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)，此外，使用ANXA1進行胰島預培養(yǎng)可增加糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力[9]。本研究中，經(jīng)hrANXA1治療后，小鼠的OGTT AUC值顯著降低，而血清胰島素水平顯著升高。說明外源性hrANXA1對胰島功能具有一定的促進作用。

高血糖癥會導致促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號的活化，并引起心臟和腎臟肥大和纖維化[10]。MAPK信號通路的激活可促進組織和器官中的炎性反應和纖維化。抑制MAPKs可減少嚙齒動物中由T1D引起的微血管并發(fā)癥[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)hrANXA1治療后，T1D小鼠心臟和腎臟組織中MAPK的3個亞族(p38、JNK和ERK1/2)的磷酸化水平均顯著降低。因此，推測這些已知的促炎性和纖維化信號通路的過度激活是T1D的關鍵驅(qū)動因素。用hrANXA1治療T1D小鼠可通過抑制MAPK信號來減輕高血糖、炎性反應、纖維化引起的器官功能障礙。

Akt是磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)信號傳導途徑的成員。胰島素信號通過IRS-1調(diào)節(jié)PI3K活性，PI3K可以激活Akt從而控制炎性反應[12]。多項研究證實，Akt生存途徑的激活可減少器官損傷。此外，激活Akt可以有效減少心臟和腎臟組織壞死[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)hrANXA1治療后，小鼠心臟和腎臟組織中Akt磷酸化水平顯著升高。說明外源性hrANXA1可通過激活Akt生存途徑來保護T1D小鼠的心臟和腎臟。

總之，本研究表明T1D患者血漿中ANXA1水平降低。外源性hrANXA1治療對T1D小鼠心臟和腎臟的保護作用與抑制MAPK信號通路和激活Akt生存途徑有關。