楊萌哲 ，徐 寧，成南南，郭興喆 ,白先愚，呂安喬，楊建宇，黃元姣，△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.生物分子醫(yī)學(xué)研究實驗室；2.生命科學(xué)研究院，南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是起源于鼻咽的上皮，由鼻咽黏膜內(nèi)膜引起的惡性腫瘤。廣東、廣西的鼻咽癌發(fā)病率和死亡率高于中國其他地區(qū)[1]。鼻咽癌早期僅以放射治療作為主要治療方法，而局部晚期疾病則需要化學(xué)療法與放射療法相結(jié)合進行治療[2]。但是遠處轉(zhuǎn)移仍然是一個問題[3]。尋求治療新途徑，是有效控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。其中，通過中藥輔助化療成為近年來鼻咽癌高發(fā)地區(qū)探索鼻咽癌治療的新方向。中藥單體是從傳統(tǒng)的中草藥中提取的有效活性成分。中藥單體以其高效、毒性小、價格低廉等優(yōu)點，被作為潛在的治療藥物進行廣泛研究[4]。甘草查爾酮A（licochalcone A，LCA）是一種從甘草根部中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗血管生成的作用[5-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究的一個新領(lǐng)域，可以利用現(xiàn)有的多種數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)分析方法，探討治療性化合物在疾病中的作用機制[9-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過建立藥物－成分－靶點網(wǎng)絡(luò)以預(yù)測藥物有效成分從而揭示藥物與疾病的相互關(guān)系，已逐漸成為現(xiàn)代中藥研究的熱門工具[11]。這種理論方法可以快速準確的區(qū)分潛在的藥物－靶點相互作用，為實驗研究提供支持證據(jù)[12]。研究表明，LCA 降低NPC 細胞活力，并通過JNK/p38 途徑誘導(dǎo)NPC 細胞凋亡[13]。本研究將從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度分析LCA 治療NPC 的潛在核心靶點和生物學(xué)功能，驗證LCA抗NPC的分子機制，為LCA的開發(fā)利用及NPC的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 LCA潛在靶點的獲取 為了預(yù)測LCA的作用靶點，登陸PubChem 分子庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[14]，檢索選擇species為Homo sapiens，其余參數(shù)均為默認設(shè)置，進行預(yù)測。下載LCA 的3D-SDF 格式，再導(dǎo)入Swisstarget 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），篩選Probability＞0，得到預(yù)測靶點。接著，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uploadlists/）進行靶點蛋白和基因信息校正，得到相應(yīng)的基因名稱數(shù)據(jù)庫，方便進一步的數(shù)據(jù)分析。

1.2 NPC 相關(guān)基因靶點的獲取 通過GeneCards網(wǎng)站（https://www.genecards.org/）檢索靶點，輸入關(guān)鍵詞為“nasopharyngeal carcinoma”，獲得與鼻咽癌相關(guān)基因的靶點。

1.3 篩選LCA靶點和NPC相關(guān)的共同靶點 將獲得的NPC 相關(guān)基因和LCA 作用靶點輸入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）,篩選出共同靶標基因，作為LCA對NPC的潛在作用靶標。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) STRING（https://string-db.org/，版本10.5）數(shù)據(jù)庫是提供有關(guān)蛋白質(zhì)預(yù)測和相互作用的信息，用于分析蛋白質(zhì)的PPI[15]。將LCA對NPC潛在作用靶標導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類（human sapiens），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出結(jié)果。

1.5 關(guān)鍵靶點生物功能注釋及通路分析 基因本體（gene ontology,GO）富集分析包括生物過程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和細胞成分（celluar component,CC）。我們利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO 富集分析，以進一步研究41 個共同靶點的生物學(xué)過程。通過京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析（https://www.kegg.jp/）對通路進行分類，獲得了有關(guān)LCA治療NPC關(guān)鍵靶點的相關(guān)途徑，篩選出LCA治療NPC的信號通路。

1.6 建立“藥物－靶點－疾?。贰本W(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape-v3.6.1 軟件構(gòu)建“藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型，其中“節(jié)點”代表化合物或靶標，“邊”代表相互作用的關(guān)系，對結(jié)果進行進一步分析，以確定網(wǎng)絡(luò)模型中的相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 LCA 潛在靶點的獲取 通過PubChem 分子庫獲得LCA 的3D 結(jié)構(gòu)，見圖1。Swisstarget 數(shù)據(jù)庫篩選出LCA靶點以及利用Uniprot數(shù)據(jù)庫并進行進一步校正，建立藥物－靶點數(shù)據(jù)庫。按照Probability排序，選取前10個基因名稱和靶點，見表1。

2.2 LCA 靶點和NPC 相關(guān)的共同靶點 從Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫獲得與NPC 相關(guān)的基因靶點共有1 786 個。將1 786 個NPC 相關(guān)基因與91 個藥物靶點基因通過Venny2.1映射篩選出共同靶點41個，確定為LCA治療NPC的潛在靶點基因，見圖2。

圖1 LCA的3D結(jié)構(gòu)

表1 LCA排名前10的潛在靶點

圖2 LCA與NPC靶點韋恩圖

2.3 LCA 和NPC 相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò) 從系統(tǒng)的角度來看，PPI 網(wǎng)絡(luò)是了解復(fù)雜疾病中多種蛋白質(zhì)的多因素功能的基礎(chǔ)。因此，構(gòu)建了LCA和與NPC相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。PPI包含41個節(jié)點，其中每個節(jié)點表示一種蛋白質(zhì)，每條邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。其中RAF1、BRAF、RPS6KB1這些靶點有較多的相互作用，這也為進一步研究各靶點之間的功能提供依據(jù)。

2.4 GO功能富集分析 GO富集分析包括BP、CC和MF 3個部分，說明LCA發(fā)揮抗腫瘤的作用，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，BP中富集靶點較多的有蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）等。CC中富集靶點較多在細胞質(zhì)膜（cytoplasm）等。MF中富集靶點較多在蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）以及ATP結(jié)合（ATP binding）等。

圖3 LCA治療NPC 的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG 功能富集分析 將41 個共同靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，利用KEGG分析得到65個信號通路。從圖5 可見，關(guān)鍵靶點主要富集在癌癥相關(guān)信號通路(pathways in cancer)、酒精通路（alcoholism）、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)以及癌癥微小核糖核酸表達通路(microRNAs in cancer)等。其中癌癥相關(guān)信號通路共有11 個靶基因；酒精通路共有8 個靶基因；MAPK 信號通路共有8個靶基因；癌癥微小核糖核酸表達通路共有7 個靶基因。

2.6 “藥物－靶點－疾?。贰本W(wǎng)絡(luò)模型 構(gòu)建“藥物－靶點－疾?。贰本W(wǎng)絡(luò)模型，表明LCA與NPC 靶點之間的相互作用以及關(guān)鍵途徑，如圖6 所示，41 個左側(cè)節(jié)點代表NPC 的靶點，20 個右側(cè)節(jié)點表示化合物作用的關(guān)鍵通路。涉及的關(guān)鍵基因主要有：MAPK14、MAPK10、MAPK1以及RAF1等。

圖4 LCA治療NPC的GO功能富集分析

圖5 LCA治療NPC的KEGG富集分析

圖6 “藥物－靶點－疾病－通路”網(wǎng)絡(luò)模型

3 討論

本研究篩選出NPC 與LCA 的共同作用靶點共41 個。GO 功能富集分析顯示，生物過程和功能主要富集在蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過程的負反饋調(diào)節(jié)、細胞質(zhì)以及分子功能蛋白質(zhì)黏合等。研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化可以協(xié)調(diào)多種細胞功能，例如細胞生長，分化和凋亡。但磷酸化途徑的改變會導(dǎo)致嚴重疾病，尤其是癌癥[16]。組蛋白H3 在絲氨酸10 位點（Ser10）的磷酸化，具有致癌作用，并直接調(diào)控表皮細胞生長因子或組織型纖溶酶原激活劑,誘導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)化和細胞增殖[17-18]。在多種結(jié)直腸癌細胞中也觀察到有絲分裂組蛋白H3 Ser10 磷酸化增強[19]。有研究表明，組蛋白H3 磷酸化的增加可能是鼻咽癌發(fā)病過程中的重要事件，促進了鼻咽上皮的惡性轉(zhuǎn)化[20]。

通過KEGG 功能富集分析表明LCA 抗NPC 作用的通路主要有癌癥相關(guān)信號通路、酒精通路、MAPK 信號通路以及癌癥微小核糖核酸表達通路等。其中，富集最多的是癌癥相關(guān)信號通路，包括p53 信號通路、NF-κB 信號通路、Ras-Raf 信號通路、Wnt 信號通路以及TGF-β 信號通路等。p53 是一種眾所周知的抑癌基因，被定義為“癌癥特征的潛在過程的協(xié)調(diào)者”。它在預(yù)防癌癥發(fā)展中起著重要的作用。p53 蛋白是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可被多種應(yīng)激信號激活，通過調(diào)控DNA 修復(fù)、細胞周期和細胞凋亡來防止遺傳損傷的積累[21]。研究表明，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白PBK 通過抑制p53 的表達抑制DNA 損傷檢查點，從而促進腫瘤細胞的生長[22]。NF-κB通路在鼻咽癌研究進展中起著十分重要的作用。NF-κB異常活化可能是腫瘤細胞在腫瘤發(fā)生過程中主要的抗凋亡途徑之一[23]。有研究表明，纖維連接蛋白1（FN1）通過NF-κB 通路中的p65 途徑調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞凋亡[24]。NKILA（一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA）通過NF-κB通路調(diào)控鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，在鼻咽癌的發(fā)病機制中起著重要的作用[25]

“藥物－靶點－疾?。贰本W(wǎng)絡(luò)圖顯示關(guān)鍵基因主要有：MAPK14、MAPK10、MAPK1、RAF1等。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，包括Ras/ERK 信號通路、JNK 信號通路、p38信號通路3 種信號通路，主要在細胞增殖、細胞代謝、細胞遷移、有絲分裂、分化和凋亡中的調(diào)控起作用[26-28]。MAPK14 基因表達p38α 的蛋白質(zhì)，p38α 主要由細胞周期進程的負調(diào)控和細胞凋亡的誘導(dǎo)介導(dǎo)[29]。有研究結(jié)果表明，LCA 通過JNK/p38 途徑誘導(dǎo)NPC 細胞凋亡[13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析也證實了MAPK14是LCA抗NPC的關(guān)鍵靶點。此外，Raf 在癌癥中的進展和促進癌癥生長中的重要性已得到了公認[30]。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度成功實現(xiàn)了LCA 和NPC 的藥效關(guān)系構(gòu)建以及可視化目標網(wǎng)絡(luò)，并且驗證了已有實驗的有效性。因此，將古老的中醫(yī)藥與新興的網(wǎng)絡(luò)技術(shù)聯(lián)系起來，將為發(fā)現(xiàn)中藥藥理作用、活性成分和生物標志物，揭示潛在的作用機制提供新穎的方法和機會[31-32]。