莫軍揚，張敏敏，唐 茜，盧林捷，陳 巖，韋業(yè)剛，覃舒婷

（廣西柳州市人民醫(yī)院普外三科，柳州 545006）

微小RNA(mi RNAs，miR)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，具有抑癌基因或類癌基因的功能，影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在乳腺癌的診斷、預后、耐藥等多方面起了重要作用[1-2]。本研究運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測乳腺癌患者癌組織中miR-206 的表達，探討其與患者臨床特征、激素受體之間是否存在相關性，以期能成為一種新的預測患者預后及內(nèi)分泌治療敏感度的標記物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月～12月于廣西柳州市人民醫(yī)院普外三科住院、治療完整的100例女性乳腺癌患者的腫瘤組織標本，患者年齡39～61 歲，平均(50.08±10.85)歲；所有患者均按WHO乳腺腫瘤分類標準進行病理學分型，其中TNM 分期分為I 期25例，Ⅱ期56例，Ⅲ期19例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；病理類型：浸潤性導管癌95例，中分化腺癌1例，小葉癌2例，導管內(nèi)癌2例。所有患者在采集組織標本前均未經(jīng)放、化療治療，且無炎癥等合并癥。

1.2 主要試劑

Hipure FFPE miRNA Kit 提取分離試劑盒購自廣州Magen 公司；ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海ToYoBo 公司；PCR 采用KAPA Probe Fast qPCR Master Mix試劑盒購自北京KAPA公司；定量PCR儀購自上海安捷倫公司，型號Mx3005P。

兔抗人雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，RP）一抗購自美國Cell Signaling；羊抗兔二抗、多聚甲醛、石蠟、檸檬酸緩沖液和蘇木精等免疫組化試劑購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 miR的提取與miR反轉(zhuǎn)錄 miR的提取按照Hipure FFPE miRNA Kit操作說明提取；miR反轉(zhuǎn)錄按照ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit 操作說明進行。qPCR 反應：上游引物分別為U6F、miR206，下游引物共同為miR27-R。反應條件：95 ℃3 min；95 ℃3 s，55 ℃，30 s，讀FAM 熒光數(shù)值，40 循環(huán)；30 ℃30 s。miRNA 成熟序列及引物序列，見表1。以參照基因U6 和miR-206 基因作為標準，采用2-△△Ct方法進行計算。

表1 miRNA成熟序列及引物序列

1.3.2 免疫組化檢測乳腺癌組織ER、RP表達 使用免疫組織化學檢測(即用型超敏二步法)：（1)烤片后二甲苯浸泡，再用酒精逐級浸泡切片以水化組織，PBS 沖洗。（2）枸椽酸鈉緩沖液微波加熱至98 ℃，再把切片放入，小火處理；從緩沖液中取出玻片，以PBS沖洗。（3）為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片滴加3% H2O 去離子水，37 ℃孵育，PBS沖洗。（4）滴加一抗4 ℃冰箱過夜，室溫下放置復溫，用PBS 沖洗。（5)滴加聚合物輔助劑37 ℃孵育，PBS沖洗。（6)滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG(羊抗兔IgG 多聚體)，37 ℃孵育，PBS沖洗.（7）滴加DAB溶液，用顯微鏡控制顯色的時間，自來水沖洗終止。（8）復染、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果，由兩名副高職稱的病理醫(yī)生進行結(jié)果判定。ER、PR 陽性標準為：≥1%腫瘤細胞核陽性，根據(jù)陽性細胞數(shù)比例分為：0～25%為（+），26%～50%為（++），51%～75%為（+++），75%以上為（++++）。

1.4 隨訪

采取門診復查或電話隨訪，隨訪時間截止至2017年12月。失訪10例，90例患者隨訪滿36 個月，隨訪率為90%。主要觀察指標為乳腺癌無病生存率（DFS，即從明確診斷為乳腺癌開始至疾病復發(fā)的時間）。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；相關分析采用Spearman 相關分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ER、PR在乳腺癌組織中的表達

ER、PR染色位于乳腺癌細胞的細胞核，其表達強度的不同，可呈淺棕色至深棕色，見圖1、圖2。100例乳腺癌患者中，ER 表達陽性77例，陽性率77%。PR表達陽性66例，陽性率66%。

圖1 乳腺癌組織中ER 染色陽性結(jié)果（左圖）和陰性結(jié)果（右圖）(免疫組化×200)

2.2 乳腺癌組織中miR-206 的表達與臨床病理參數(shù)的關系

腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者癌組織中miR-206表達水平低于陰性患者（P＜0.05）；在乳腺癌患者中，miR-206在腫瘤直徑≥2.0 cm癌組織中的表達水平低于腫瘤直徑＜2.0 cm 者，腋窩淋巴結(jié)移患者miR-206表達水平低于無轉(zhuǎn)移患者，Ⅰ、Ⅱ期相比Ⅲ期患者，miR-206表達量水平上調(diào)（P＜0.05），見表2。

圖2 乳腺癌組織中PR 染色陽性結(jié)果（左圖）和陰性結(jié)果（右圖）(免疫組化×200)

表2 miR-206表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系

2.3 乳腺癌組織中miR-206 和ER、PR 表達的相關性

乳腺癌組織中miR-206 和ER 表達呈負相關關系（r=-0.274，P＜0.05）；miR-206 與PR 表達無相關性（P＞0.05），見表3。

表3 乳腺癌中miR-206和ER、PR表達相關性

2.4 乳腺癌組織中miR-206 表達和DFS 之間的相關性

對乳腺癌患者進行36個月的追蹤隨訪，以miR-206相對表達中位值2－△△Ct=-2.12作為截斷值，Kaplan-Meier 分析表明，癌組織中miR-206 低表達者，DFS 下降；無病生存時間低表達組平均33.3 個月(95%CI：31.9～34.7)，高表達組平均35.3 個月(95%CI：34.6～35.9)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.381，P=0.036)，見圖3。

圖3 miR-206表達水平與DFS的關系

3 討論

乳腺癌是一種激素依賴型腫瘤，臨床上也多依據(jù)癌組織ER、PR的表達情況，來制定乳腺癌患者內(nèi)分泌治療方案及評估預后[3]。miRNA通過癌基因或抑癌基因的方式參與了乳腺腫瘤細胞的生長發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導過程，并且部分miRNA經(jīng)基因芯片分析顯示其具有激素應答功能[4]，這均提示miRNA的研究有望為評估乳腺癌患者預后和預測內(nèi)分泌治療敏感度提供一項可靠指標。

研究發(fā)現(xiàn)miR-206 為抑癌基因[5-7]，在多種惡性腫瘤中均表達下調(diào)，原理可能為miR-206作用于cyclinD2、Notch3等蛋白抑制乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移，同時還下調(diào)ERa 以及ERa 共調(diào)節(jié)蛋白的mRNA 和蛋白表達[8-9]。本課題組結(jié)果顯示，miR-206 與乳腺癌的腫瘤大小、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關，并與患者DFS 呈正相關關系（P＜0.05），說明miR-206 的表達下降，乳腺腫瘤的遷移和侵襲能力可能降低，提示miR-206 對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。

miR-206 對乳腺癌細胞ER 的表達可能起到負調(diào)控作用：(1)Chen 等[10]發(fā)現(xiàn)ERα 受體的mRNA3’UTR 端有兩個miRNA-206 結(jié)合位點，miRNA-206與位點結(jié)合后，導致ERα受體數(shù)量下調(diào)。(2)近期報道提示將miR-206 轉(zhuǎn)染入雌激素依賴的乳腺癌MCF-7 細胞系中，癌細胞ERα 表達下調(diào)[11]。本研究結(jié)果顯示，miR-206在乳腺癌組織中的表達與ER的表達呈負相關關系（P＜0.05），這與既往研究報道一致，預示miR-206 可作為一項新指標評測乳癌患者內(nèi)分泌治療的敏感性，指導臨床醫(yī)師制定個體化治療方案。本研究通過對miR-206 和PR 進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)二者無相關性（P＞0.05），可能與miR-206的作用機制有關，多項研究發(fā)現(xiàn)miR-206 主要通過下調(diào)ER 調(diào)節(jié)蛋白、mRNA 表達[9]，或直接作用于Notch3、Cdc42等蛋白，從而抑制癌細胞增殖、遷移，未經(jīng)過PR及相關作用途徑。

本研究的結(jié)果提示，miR-206 有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標志物，可用于乳腺癌的預后評估及內(nèi)分泌藥物敏感度判斷，幫助患者合理的選擇治療方案，提高患者生存率。目前最新報道認為miR-206可能是乳腺癌患者由內(nèi)分泌治療不敏感型轉(zhuǎn)化為敏感型的開關[12]，這一特性使其可能作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的基因切入點，進一步研究可讓miRNA在乳腺癌患者中更具臨床價值。