周曉桐，陳海洋，蘇 鵬

（遼陽市中心醫(yī)院胸外科，遼陽 111000）

肺癌是世界上最為常見的一種惡性腫瘤，也是一種具有侵襲性的疾病，其發(fā)病率和死亡率高，嚴重威脅人類健康，如何降低肺癌發(fā)病、尋找更有效的治療手段是目前醫(yī)學面臨的重點和難點[1]。近年來，分子靶向治療在肺癌的臨床研究與應用中取得一定進展，成為肺癌治療的新方法。lncRNA 在肺癌組織中的異常表達參與了肺癌的進展過程，其可作為肺癌中分子標志物[2]。TDRKH 反義RNA1（TDRKH antisense RNA 1，TDRKH-AS1）是一種lncRNA，有研究報道，具有拷貝數(shù)改變的差異表達的TDRKH-AS1與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系，而拷貝數(shù)擴增與TDRKH-AS1 表達增加顯著相關[3]。TDRKH-AS1 在大多數(shù)結直腸癌患者中上調表達，并與其較差的預后密切相關；TDRKH-AS1可通過靶向激活Wnt 信號通路中的β-連環(huán)蛋白（βcatenin）促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲；有望作為預后預測指標和潛在的治療靶標[4]。miRNAs 是一種新型腫瘤標記物，其可作為肺癌診斷和治療的靶點[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-544a 可促進肺癌細胞的侵襲和轉移[6]。LEF1-AS1 可通過調節(jié)miR-544a/叉頭框轉錄蛋白P1（Forkhead box protein P1，F(xiàn)OXP1）軸促進肺癌的增殖和侵襲[7]。然而，TDRKH-AS1對肺癌細胞增殖、遷移侵襲的影響及其是否通過調控miR-544a 起作用還尚未可知。因此，本實驗旨在研究TDRKH-AS1是否通過調控miR-544a影響肺癌細胞增殖、遷移侵襲。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取遼陽市中心醫(yī)院胸外科2018年5月至2020年5月收治的肺癌患者30例作為研究對象，取其癌組織和相應的癌旁組織；距離癌組織邊緣2～5 cm 處切除的為癌旁組織。診斷標準符合2010年衛(wèi)生部公布的《原發(fā)性肺癌診斷標準》。病例納入標準：（1）所有患者經臨床、影像學、病理檢測確診為肺癌；（2）所有患者術前未經過放化療；（3）所有患者病理資料完整。排除標準：（1）合并有其他癌癥的患者；（2）有心、肝、腎等其他嚴重的身體疾病的患者；（3）不同意采集組織標本的患者；（4）有家族腫瘤史的患者。30例患者中，男21例，女9例，年齡24～78 歲，平均（35.2±1.4）歲。本研究已取得本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 材料 肺癌細胞A549（貨號：FE177，美國ATCC）；胎牛血清（貨號：10099-141，美國Gibco 公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號：R1145，美國Sigma公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：WE0149-RLU，北京百奧萊博科技有限公司）；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）（貨號：40203ES76，上海翊圣生物科技有限公司）；Transwell 小室（貨號：3452）、Matrigel（貨號：356234）（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：D0010，北京索萊寶科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號：LM-3201-1，上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；BCA 試劑盒（貨號：XY-MY-0096，上海烜雅生物科技有限公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組 將肺癌細胞A549接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中進行常規(guī)培養(yǎng)，將pcDNA、pcDNA-TDRKH-AS1 分別轉染至A549 細胞中，記為陰性對照（pcDNA）組、TDRKHAS1 過表達（pcDNA-TDRKH-AS1）組；將pcDNATDRKH-AS1分別與miR-544a模擬物及其陰性對照（miR-NC）共轉染至A549 細胞中，記為pcDNATDRKH-AS1+miR-NC組、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a組。

1.4 qPCR 檢測TDRKH-AS1mRNA 和miR-544a 的表達水平 提取癌組織以及pcDNA組、pcDNATDRKH-AS1組細胞的總RNA，miRNA 和lncRNA分別按照專用試劑盒逆轉錄合成cDNA，其中miRNA 采用莖環(huán)法進行逆轉錄，具體步驟：取1 μL 總RNA（約1 μg）補水至5.1 μL，將其與4.1 μL 的逆轉錄體系（2 μL 5×逆轉錄Buffer，1 μL dNTP mix，0.2 μL 重組RNA 酶抑制劑，0.4 μL 高效逆轉錄酶，0.5 μL 特異性莖環(huán)逆轉錄引物）混勻，42 ℃1 h，95 ℃5 min；然后取cDNA 按照熒光定量PCR 試劑盒使用說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。TDRKH-AS1 和miR-544a 分別以GAPDH 和U6 為內參；TDRKH-AS1 上游：5’-GGACAGGAAGTCAAGGGACA-3’，下游：5’-GGAGTTGGAGGTTCCAGTGA-3’；GAPDH 上游：5’-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3’，下游：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’；miR-544a 上 游：5’-ATTCTGCATTTTTAGCAAGTTC-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’。

1.5 CCK-8 檢測細胞存活率 選擇“1.3”中4組細胞，按試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測450 nm處吸光度值（A）。細胞存活率(%)=實驗組A 值/空白對照組A值×100%。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù) 取“1.3”項中4組細胞，制成1×103個/mL 細胞懸液，將其接種于6 孔板中，每孔100 個細胞，培養(yǎng)2 周后用PBS清洗，然后甲醇固定、吉姆薩染色，最后用低倍光學顯微鏡下計數(shù)＞50個細胞的集落。

1.7 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲細胞遷移 將“1.3”項中4組對數(shù)生長期A549 細胞以無血清培養(yǎng)基制備濃度為5×103個/mL 細胞懸液。Transwell 小室上室加入100 μL細胞懸液，下室加入含血清培養(yǎng)基500 μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽將上室中殘留的細胞輕輕擦去后，以甲醛固定細胞30 min，并滴加0.1%結晶紫染色15 min。然后采用倒置顯微鏡觀察計數(shù)。細胞侵襲實驗除用Matrigel基質膠包被Transwell小室上室外，其余與遷移實驗操作相同。

1.8 熒光素酶報告實驗檢測TDRKH-AS1 和miR-544a 的靶向關系 構建野生型和突變型基因靶點TDRKH-AS1 的熒光素酶表達載體WT-TDRKHAS1 和MUT-TDRKH-AS1，將其分別與miR-NC 和miR-544a 共轉染至A549 細胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 蛋白質印跡（Western blot）法檢測蛋白表達

提取“1.3”項中4組細胞總蛋白，用BCA試劑盒定量。所有蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜上，用5%的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗（1∶800）置于4 ℃冰箱孵育過夜，加入二抗（1∶200）室溫培養(yǎng)1 h，加入化學發(fā)光試劑顯影，分析各蛋白條帶灰度水平，以GAPDH 為內參計算蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-544a 和TDRKH-AS1 mRNA 在 肺癌中的表達 用qPCR 檢測肺癌組織及癌旁組織中TDRKH-AS1 mRNA 和miR-544a 的表達水平，結果顯示，與癌旁組織相比，肺癌組織中TDRKH-AS1 mRNA 表達水平降低，miR-544a 表達水平升高（均P＜0.05），見表1。

表1 miR-544a和TDRKH-AS1 mRNA的表達

2.2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響 將pcDNA-TDRKH-AS1 及pcDNA 轉染至A549細胞中，檢測細胞增殖、遷移侵襲情況，結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-TDRKH-AS1組TDRKH-AS1 表達水平升高，miR-544a 表達水平降低，細胞存活率降低，克隆形成數(shù)減少，遷移侵襲細胞數(shù)減少（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 TDRKH-AS1 對A549 克隆形成和遷移侵襲細胞數(shù)的影響

2.3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響 將pcDNA-TDRKH-AS1 分別與miR-544a模擬物及miR-NC轉染至A549細胞中，檢測細胞增殖、遷移侵襲情況，結果顯示，與pcDNATDRKH-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-TDRKHAS1+miR-544a組細胞存活率升高，克隆形成數(shù)增多，遷移侵襲細胞數(shù)增多（P＜0.05），見圖2、表3。

表2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響

表2 TDRKH-AS1對A549增殖、遷移侵襲的影響

圖2 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549克隆形成和遷移侵襲細胞數(shù)的影響

表3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響

表3 miR-544a能逆轉TDRKH-AS1對A549增殖遷移侵襲的影響

2.4 TDRKH-AS1 靶向miR-544a LncBase Predicted v.2 預測顯示，TDRKH-AS1 與miR-544a 具有互補的核苷酸序列，見圖3。miR-544a 與WTTDRKH-AS1共轉染的細胞熒光素酶活性低于miRNC 與WT-TDRKH-AS1 共轉染的細胞（P＜0.05），見表4。

2.5 A549中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的檢測 將pcDNA-TDRKH-AS1 及pcDNA 轉染至A549 細胞中，pcDNA-TDRKH-AS1 分別與miR-544a模擬物及miR-NC轉染至A549細胞中，檢測相關蛋白表達水平，結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-TDRKH-AS1組A549 細胞中Ki67、N-cadherin表達水平降低，A549 細胞中E-cadherin 表達水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a組A549細胞中Ki67、N-cadherin 表達水平升高，A549 細胞中Ecadherin表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表5。

圖3 TDRKH-AS1靶向miR-544a

表4 雙熒光素酶實驗

表4 雙熒光素酶實驗

圖4 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表5 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

與pcDNA組相比，*P＜0.05；與pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC組相比，#P＜0.05。

3 討論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)有治療手段雖取得一定療效，但急需針對基因突變的治療手段，近年來，新的靶點和新的靶向藥物的出現(xiàn)使分子靶向治療成為治療肺癌的新途徑[8]。而尋找新的特異性靶點，研發(fā)新的靶向藥物是目前靶向治療的關鍵。lncRNA 參與調控腫瘤的進展，其可作為抗腫瘤藥物新靶點，以lncRNA 為靶點開發(fā)抗腫瘤新藥將是未來抗腫瘤藥物研發(fā)的趨勢[9]。已有研究表明，TDRKH-AS1 拷貝數(shù)與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系，而拷貝數(shù)擴增與TDRKH-AS1 表達增加相關[3]，推測TDRKH-AS1表達增加可能與肺腺癌患者的總生存期呈正相關關系。本實驗結果顯示，肺癌組織中TDRKH-AS1 表達水平降低（P＜0.05），表明TDRKH-AS1在肺癌中可能作為抑癌基因起作用，與前人研究結果相吻合。此外，TDRKHAS1 可促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲[4]。而TDRKH-AS1在對肺癌細胞生物學行為的影響尚不清楚。本實驗過表達TDRKH-AS1后可降低細胞存活率，減少克隆形成數(shù)和遷移侵襲細胞數(shù)，且降低了Ki67、N-cadherin 蛋白表達水平，提高了E-cadherin蛋白表達水平（均P＜0.05）。Ki67是細胞增殖核標志物，其高表達可反映細胞增殖增多；N-cadherin、E-cadherin 是上皮間質轉化過程中的標志分子，影響細胞遷移和侵襲。因此，過表達TDRKHAS1可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA 的失調與腫瘤的進展密切相關[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-544a過表達通過下調AXIN2表達促進人骨肉瘤細胞增殖[11]。抑制miR-544a 可減少結直腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲[12]。且miR-544a可促進肺癌細胞侵襲和轉移[6]。本實驗結果表明，肺癌組織中miR-544a 表達水平升高（P＜0.05），結合前人研究結果，miR-544a 可能參與肺癌的進展過程，且可能在肺癌中起促癌作用。研究表明，LncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[13]。在肺癌組織和細胞中miR-544a表達上調；TINCR 充當競爭性內源RNA 下調miR-544a 抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，TDRKH-AS1 靶向調控miR-544a。同時，過表達TDRKH-AS1 和miR-544a 后，A549 細胞存活率升高，克隆形成數(shù)和遷移侵襲數(shù)增多（均P＜0.05），表明miR-544a 過表達逆轉了TDRKH-AS1 對A549 細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

綜上所述，過表達TDRKH-AS1 可能通過下調miR-544a抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。