何 琳，楊志峰，袁 鴻，宋 冉，劉 丹

（河北省保定市第二醫(yī)院婦科，保定 071051）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma）起源于高度再生的子宮腔，是繼乳腺癌和宮頸癌之后第3 大婦科惡性腫瘤[1]。被診斷為子宮內(nèi)膜腫瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官的患者通常治療選擇有限[2]。因此，為了開發(fā)新的治療方法，有必要更好地了解子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。腦惡性腫瘤缺失基因1（deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1）是一種340 ku 的糖蛋白，位于染色體10q25.3-q26.1上，通常參與黏膜固有免疫[3]。已有研究表明，癌組織中DMBT1 的低表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。Galectin-3 是Galectin 家族一種29～35 ku 的蛋白質(zhì)。galectin-3在子宮內(nèi)膜癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，且與癌癥進(jìn)展相關(guān)。Galectin 3 可作為子宮內(nèi)膜癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[5]。此前，已有研究表明，DMBT1 和galectin-3 間存在相互作用[6]。因此，本研究旨在探究DMBT1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用，進(jìn)一步探究其作用是否與galectin-3相關(guān)，以期為探明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的子宮內(nèi)膜癌治療策略提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞及試劑

人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EEC 和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMBT1 過表達(dá)載體、galectin-3 過表達(dá)載體及其空載體購自武漢金開瑞生物工程有限公司；Lipofectamine2000 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購自美國APExBIO 蘇州宇恒生物科技有限公司；DMBT1 和galectin-3 抗體購自英國Abcam 公司；GAPDH 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel購自美國BD公司。

1.2 臨床資料

選取2017年4月至2018年9月于河北保定市第二醫(yī)院住院經(jīng)手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織31例作為子宮內(nèi)膜癌組?；颊吣挲g35～73歲，平均（53.58±11.63）歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理確診為子宮內(nèi)膜癌；術(shù)前未接受放化療及激素治療；無其他腫瘤病史；無重要臟器嚴(yán)重功能障礙；無嚴(yán)重感染；無血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病。另外，選取同期于本院門診體檢，經(jīng)宮腔鏡取組織活檢病理證實(shí)的正常子宮黏膜組織標(biāo)本31例作為正常對照組，患者年齡32～77 歲，平均（56.06±13.15）歲。正常對照組所有患者均無其他疾病史、特殊治療史及腫瘤疾病史。子宮內(nèi)膜癌組和正常對照組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.3 免疫組化（IHC）檢測DMBT1表達(dá)

子宮內(nèi)膜癌組織及正常對照組織經(jīng)福爾馬林固定50 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明。常規(guī)石蠟包埋、切片。組織切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育4 min。10% BSA 封閉液37 ℃孵育40 min。滴加DMBT1 抗體稀釋液（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。滴加二抗（1∶200），37 ℃溫箱內(nèi)孵育40 min。PBS緩沖液洗滌切片。滴加DAB 顯色劑，室溫顯色10 min。自來水終止顯色。蘇木精染液復(fù)染，1%鹽酸酒精溶液分化3 s，藍(lán)化10 s。梯度酒精脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片。通過IHC 評分對染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計[7]，IHC評分為染色強(qiáng)度和染色面積得分之積，其中無著色、弱著色、中等著色和強(qiáng)著色分別記為0 分、1 分、2 分和3 分；染色面積＜1%、染色面積1%～10%、染色面積11%～50%、染色面積51%～80%和染色面積＞80%分別記為0分、1分、2分、3分和4分。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Ishikawa 細(xì)胞和EEC 細(xì)胞用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細(xì)胞，按照1∶3 比例傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)期生長的Ishikawa 和EEC 細(xì)胞，分別命名為Ishikawa組和EEC組，RT-PCR 和Western blot檢測細(xì)胞DMBT1 mRNA和蛋白表達(dá)。

1.5 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

接種對數(shù)期生長的Ishikawa 細(xì)胞于6 孔板中，每孔4×105個細(xì)胞。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、陰性對照（NC）組、DMBT1組和DMBT1+galectin-3組，根據(jù)Lipofectamine2000說明書，NC組轉(zhuǎn)染空載體陰性對照NC，DMBT1組轉(zhuǎn)染DMBT1 過表達(dá)載體，DMBT1+galectin-3組進(jìn)行DMBT1過表達(dá)載體和galectin-3過表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染，同時轉(zhuǎn)入Ishikawa 細(xì)胞?？瞻讓φ战M不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，加入等量PBS。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.6 RT-PCR檢測DMBT1 mRNA表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細(xì)胞。取出凍存的子宮內(nèi)膜癌組織及正常對照組織剪碎。Trizol法提取細(xì)胞和組織中的總RNA，隨后測定樣品的RNA濃度，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，此為RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中的模板，DMBT1 上游引物：5’-CCCTGGACGATGTAGAGTGC-3’，DMBT1 下游引物：5’-GGAACGGGTGATGTTGAGAAA-3’；GAPDH 上游引物：5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，GAPDH 下游引物：5’-TCCTGGAGGGATGGTGATGGG-3’。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進(jìn)檢測DMBT1 mRNA 表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)；擴(kuò)增條件：95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算DMBT1 mRNA表達(dá)。

1.7 Western blotting檢測DMBT1和galectin-3蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細(xì)胞。取出凍存的子宮內(nèi)膜癌組織及正常對照組織剪碎，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞及組織，收集上清液，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳操作。封閉液室溫封閉2 h，DMBT1抗體稀釋液（1∶1 000）、galectin-3 抗體稀釋液（1∶2 000）和GAPDH 抗體稀釋液（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。超敏ECL 發(fā)光液顯色，暗室曝光。

1.8 CCK-8檢測檢測細(xì)胞增殖能力

取Ishikawa細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液（5×103個細(xì)胞），37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 和72 h 后，向每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)板于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲

遷移：消化Ishikawa細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基終止消化后棄去，重新添加無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室，下室則加入600 μL 含20% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，甲醛固定30 min，風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，微鏡下觀察、記數(shù)。侵襲：Matrigel 按1∶8 比例稀釋后，包被Transwell小室底部膜上室面，37 ℃孵育至凝固。后續(xù)操作與遷移實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組與正常對照組組織中的DMBT1表達(dá)情況比較

子宮內(nèi)膜癌組中DMBT1 mRNA表達(dá)較正常對照組明顯降低（P＜0.05），子宮內(nèi)膜癌組中DMBT1 IHC 評分較正常對照組明顯降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 Ishikawa組與EEC組中DMBT1表達(dá)的比較

Ishikawa組中DMBT1 mRNA 及其蛋白表達(dá)較EEC組明顯降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 過表達(dá)DMBT1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

空白對照組DMBT1的蛋白表達(dá)與NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），DMBT1組DMBT1的蛋白表達(dá)較NC組明顯升高（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和NC組在24 h、48 h 和72 h 的OD 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），DMBT1組細(xì)胞在24 h、48 h 和72 h 的OD 值較NC組明顯降低（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和NC組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)比較無明顯差異（P＞0.05），DMBT1組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)較NC組明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 過表達(dá)DMBT1對galectin-3表達(dá)的影響

空白對照組和NC組中g(shù)alectin-3的蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05），而DMBT1組中g(shù)alectin-3的蛋白表達(dá)較NC組明顯降低（P＜0.05），見圖4。

2.5 過表達(dá)galectin-3 逆轉(zhuǎn)DMBT1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響

DMBT1組中DMBT1的蛋白表達(dá)較NC組明顯升高（P＜0.05），DMBT1組和DMBT1+galectin-3組中DMBT1 的蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05）；DMBT1組中g(shù)alectin-3 的蛋白表達(dá)較NC組明顯降低（P＜0.05），DMBT1+galectin-3組細(xì)胞中g(shù)alectin-3 的蛋白表達(dá)較DMBT1組明顯升高（P＜0.05）。DMBT1組細(xì)胞在24 h、48 h 和72 h 的OD 值較NC組明顯降低（P＜0.05）；DMBT1+galectin-3組細(xì)胞在48 h 和72 h 的OD 值較DMBT1組明顯升高（P＜0.05），24 h 的OD 值與DMBT1組比較無明顯差異（P＞0.05），見圖5

2.6 過表達(dá)galectin-3 逆轉(zhuǎn)DMBT1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

DMBT1組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)較NC組明顯降低（P＜0.05）；DMBT1+galectin-3組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)較DMBT1組明顯升高（P＜0.05），見圖6。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組與正常對照組組織中DMBT1的表達(dá)

圖2 Ishikawa組與EEC組中DMBT1的表達(dá)情況

圖3 過表達(dá)DMBT1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western blot檢測過表達(dá)DMBT1對galectin-3蛋白表達(dá)的影響

圖5 過表達(dá)galectin-3逆轉(zhuǎn)DMBT1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)galectin-3逆轉(zhuǎn)DMBT1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是美國最常見的婦科惡性腫瘤，2018年新增病例約63 230例，死亡病例11 350例。子宮內(nèi)膜癌病例約占女性所有癌癥病例的6%[8]。由于肥胖、高血壓、糖尿病和其他已知子宮內(nèi)膜癌危險因素的增加，年輕患者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率可能會增加[9]。子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法對晚期或復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者作用不佳[10]。因此，需要尋求新的子宮內(nèi)膜癌治療策略來改變子宮內(nèi)膜癌疾病現(xiàn)狀。

DMBT1 是一種分泌性清除劑蛋白，具有黏膜固有免疫和上皮細(xì)胞分化和再生的功能，作為先天性免疫防御分子和感染抑制劑發(fā)揮重要作用[11]。Garay等[12]的研究表明，在對幽門螺桿菌感染的反應(yīng)中，DMBT1可能介導(dǎo)了黏膜保護(hù)，降低了發(fā)生胃癌前病變的風(fēng)險。目前的研究表明，DMBT1 在宮頸鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，DMBT1 的低表達(dá)與宮頸鱗癌的FIGO 分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)DMBT1 可抑制宮頸鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。此外，DMBT1在膽管癌中的抗腫瘤作用也得到了證實(shí)[14]。本研究結(jié)果顯示，DMBT1在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)DMBT1 可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示DMBT1 在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮著抗腫瘤作用。

Galectin-3屬于β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族。Galectin-3作為一種胞漿蛋白，可以輕易地穿過細(xì)胞和質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程[15]。大量研究表明，galectin-3 以不同的方式在腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用，如介導(dǎo)腫瘤的生長、血管生成、化療抵抗、免疫抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。有研究者合成了對細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)galectin-3 具有很高靶向性的多價糖共聚物抑制劑，隨后將其處理不同腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-3抑制劑可抑制大腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散[17]。抑制galectin-3 可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性[18]。同樣的，galectin-3 也參與子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。Galectin-3 在子宮內(nèi)膜癌組織中的高表達(dá)分別與腫瘤深度、組織學(xué)分級和組織學(xué)類型顯著相關(guān)[19]。目前，已有研究表明，DMBT1 通過抑制galectin-3 表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用[20]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)DMBT1可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中g(shù)alectin-3 的表達(dá)，而過表達(dá)galectin-3 則會逆轉(zhuǎn)DMBT1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。該結(jié)果表明，DMBT1 可能通過抑制galectin-3 的表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，DMBT1 在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)DMBT1 通過抑制galectin-3的表達(dá)，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。