李夏霖，黎俊康，韋麗霜，李金壟，王 可，閆 萍

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

銅綠假單胞菌（PA）屬于一種廣泛存在的機會致病菌，常引起各種急、慢性感染，其中以肺部感染多見，常見于慢性阻塞性肺?。–OPD）、支氣管擴張、囊性纖維化（CF）等結(jié)構(gòu)性肺病的患者[1]。PA可以形成生物膜，進而保護細菌免受宿主免疫和抗菌藥物的清除[2]。PA 肺部感染發(fā)病機制復(fù)雜、治療棘手，為研究該病，許多PA肺部感染動物模型已經(jīng)被建立[3]。本實驗在國內(nèi)、外學(xué)者經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，使用改良低熔點瓊脂糖包裹PA，以氣管切開方式注入大鼠肺部，建立大鼠PA肺部感染模型，并根據(jù)細菌學(xué)、病理學(xué)特點和炎癥因子含量來對模型進行評價分析，從而為PA 肺部感染的研究提供理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 菌株 PA標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1，由丹麥哥本哈根大學(xué)醫(yī)院臨床微生物科惠贈。

1.2 實驗動物 6～8 周齡健康清潔級雄性SD 大鼠36只，體重190～210 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK桂2020-0004；動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2020-0003。所有大鼠置于SPF 級無菌動物房內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。本研究動物實驗已通過廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心倫理審查委員會審批。

1.3 主要試劑與儀器 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯（北京索萊寶科技有限公司）；1%瓊脂糖（美國BIO BASIC公司）；3%戊巴比妥鈉、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-17A 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢華美公司）。超低溫冰箱（Thermo 995）；生物安全柜（蘇凈安泰）；生化培養(yǎng)箱（恒宇SPX-300-11）；磁力攪拌器（德國IKA）。

1.4 實驗分組與處理 將36只大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組18只。實驗組通過氣管切口注入PA瓊脂糖包裹體懸液，建立PA肺部感染模型，對照組注入等量無菌瓊脂糖包裹體懸液。

1.5 瓊脂糖包裹體的制備[4]將PAO1 菌株從-80 ℃超低溫冰箱中復(fù)蘇至LB營養(yǎng)瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中生長24 h，取單個菌落接種于10 mL的LB 營養(yǎng)肉湯，放入恒溫（37 ℃）搖床中培養(yǎng)18 h。實驗組的離心管中加入2 mL菌液（對照組為無菌等量LB 營養(yǎng)肉湯）及無菌1 mL、50 ℃的瓊脂糖，迅速攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至無菌5 mL、50 ℃的石蠟油中，通過磁力攪拌器于室溫下1 500 r/min攪拌6 min，置于碎冰上冷卻10 min。將所制得瓊脂糖包裹體轉(zhuǎn)移至

1.5 mL 離心管，4 ℃下9 000 r/min 離心20 min，棄上清液，用PBS 沖洗3 次后振蕩混勻于PBS。將瓊脂糖包裹體懸液按梯度稀釋，接種到LB 營養(yǎng)瓊脂平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中生長24 h，行菌落計數(shù)。將瓊脂糖包裹體懸液稀釋成1×108CFU/mL濃度后，置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.6 肺部感染模型建立 3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量麻醉大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺上，墊高頭端，頸部備皮，用碘伏消毒3次，于頸前正中線上切一小口，逐層鈍性分離組織暴露氣管，用彎鑷挑起氣管，在軟骨環(huán)之間開一小口，將12 G彎頭灌胃針通過切口伸入，用1 mL注射器連接灌注0.15 mL PA瓊脂糖包裹體懸液，然后注入少量空氣確保灌胃針中殘留的懸液完全進入肺中，縫合氣管和皮膚切口后消毒。動物分籠飼養(yǎng)，每日觀察大鼠的進食情況與活動精神狀態(tài)。

1.7 標(biāo)本采取與處理 分別于接種后的第1、第3、第5 天，每組隨機選取6 只大鼠麻醉后無菌條件下行腹主動脈采血并處死，將血液標(biāo)本常溫靜置2 h后，2 500 r/min，離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ｉ_胸觀察肺臟大體病變并評分，無菌分離肺組織，放入無菌含2 mL PBS 的離心管或10%福爾馬林中。

1.8 肺細菌學(xué)檢查 取PBS離心管中的肺組織，于4 ℃下制成肺組織勻漿，梯度稀釋后從中取0.1 mL用涂布棒均勻地涂在瓊脂平板上，37 ℃下培養(yǎng)24 h，計算肺組織中的細菌菌落總數(shù)（CFU）。即CFU/mL=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×20。

1.9 肺大體病理觀察 打開大鼠胸腔后觀察肺大體病理改變，根據(jù)肺大體病理改變以及炎癥嚴(yán)重程度分為4 級[5]：（1）Ⅰ級：正常；（2）Ⅱ級：充血、腫脹、肺不張；（3）Ⅲ級：胸膜黏連、實變或肺不張；（4）Ⅳ級：膿腫、出血、大面積實變或肺不張。

1.10 肺組織病理觀察 將所取肺組織常規(guī)包埋切片及蘇木精－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)炎癥嚴(yán)重程度，將肺組織病理改變分為4 級[6]：（1）Ⅰ級：正常肺；（2）Ⅱ級：輕度炎癥；（3）Ⅲ級：中到重度炎癥伴有正常肺組織；（4）Ⅳ級：重度炎癥到壞死或整個肺為重度炎癥。另外，根據(jù)鏡下觀察病灶內(nèi)浸潤的炎癥細胞，多形核白細胞（PMN）≥90%、單核細胞（MN）≤10%為急性炎癥，MN≥90%、PMN≤10%或伴淋巴細胞、紅細胞和肉芽腫出現(xiàn)為慢性炎癥。

1.11 肺組織和血清中TNF-α、IL-17A含量檢測

將肺勻漿離心后取上清液，與血清標(biāo)本采用ELISA法檢測TNF-α和IL-17A水平，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，呈偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，等級資料比較采用秩和檢驗，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀況 實驗組在接種PA瓊脂糖包裹體后的第1 天，出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、體重減輕以及眼、口、鼻分泌物增加等現(xiàn)象；第3 天實驗組大鼠精神狀態(tài)差，伴有明顯喘鳴音；第5天實驗組大鼠仍有喘鳴，毛發(fā)雜亂無光澤。對照組接種無菌瓊脂糖包裹體后第1天，大鼠除體重下降外，無其他明顯癥狀；第3、第5天大鼠體重恢復(fù)，狀況良好。

2.2 肺組織細菌學(xué)結(jié)果 實驗組接種后第1、第3、第5天均培養(yǎng)出較高濃度PA，分別為1.34×108CFU/mL（9.01×107～2.32×108）CFU/mL、2.90×107CFU/mL（4.50×106～7.15×107）CFU/mL、1.48×106CFU/mL（5.88×105～4.85×106）CFU/mL，對照組均未培養(yǎng)出PA。

2.3 肺組織大體病理改變 實驗組肺多為Ⅳ級病變。實驗組接種后第1 天可見肺大體嚴(yán)重充血、水腫、出血；第3 天肺局部實質(zhì)變和結(jié)節(jié)形成等表現(xiàn)；第5天肺大面積實變，有膿腫形成，或伴肺外胸壁黏連等；對照組接種后第1 天肺有輕度充血，第3、第5天為肺正常組織外觀，見圖1、表1。

2.4 肺組織病理改變 實驗組肺多為Ⅲ～Ⅳ級病變，接種后第1 天肺組織中大量PMN 浸潤，呈急性炎癥反應(yīng)，并出現(xiàn)肺泡出血、肺血管擴張和氣管腔及肺泡腔內(nèi)大量膿性分泌物等，第3天可見PMN減少，MN 逐漸增多，肺泡壁較前增厚，氣管腔和肺泡腔膿性分泌物減少；第5天可見大量MN浸潤，以單核巨噬細胞為主，并伴有淋巴細胞增生，呈慢性炎癥反應(yīng)，并有纖維組織增生、肺泡間隔增粗等。對照組接種后第1天，肺局部可見少許炎癥細胞浸潤，第3、第5天恢復(fù)為正常肺組織，見圖2、表2。

2.5 兩組TNF-α、IL-17A含量比較 接種后第1、第3、第5天，實驗組血清和肺組織中TNF-α、IL-17A含量均高于對照組（P＜0.05），且第5天血清和肺組織TNF-α、IL-17A 含量均高于接種后第1 天（P＜0.01），見圖3。

圖1 兩組肺組織大體病理改變

表1 兩組肺組織大體病理評級比較 n

圖2 兩組肺組織病理改變（HE染色，×250）

表2 兩組肺組織病理評級比較 n

圖3 兩組血清和肺組織TNF-α和IL-17A含量比較

3 討論

PA 引起患者感染時，常處于生物膜狀態(tài)[7]。為模擬PA 的生物膜狀態(tài)，Cash 等[8]使用瓊脂包裹PA，但瓊脂熔點高，較易凝固，包裹PA的效果差，故本實驗改良該方法，使用1%濃度的低熔點瓊脂糖包裹PA感染大鼠，建立PA肺部感染動物模型。

按照Pearson 等[9]肺部感染模型標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)肺組織勻漿培養(yǎng)均有PA 生長，含菌量＞1×103CFU/mL，且肺組織病理可見肺組織水腫、實變、纖維滲出、大量炎癥細胞浸潤和肺泡出血等則可認為該肺部感染模型建立成功。本實驗中的實驗組大鼠各個時間點肺組織勻漿菌落計數(shù)結(jié)果均遠高于1×103CFU/mL；在病理學(xué)檢查結(jié)果方面本實驗?zāi)Ｐ鸵卜仙鲜瞿Ｐ蜆?biāo)準(zhǔn)。并且，肺部病理學(xué)結(jié)果顯示大鼠在接種PA瓊脂糖包裹體后的第1天，肺組織可見大量PMN浸潤，呈急性炎癥反應(yīng)，第3、第5天，肺組織PMN逐漸減少，而單核巨噬細胞、淋巴細胞等慢性炎癥細胞逐漸增多，并伴有肺泡間隔增厚和纖維組織增生等慢性炎癥表現(xiàn)。大鼠的肺部感染呈現(xiàn)了從急性炎癥表現(xiàn)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y的過程。因此，本實驗采用氣管切開法建立的大鼠PA 肺部感染模型可用于PA急慢性感染的研究。

PA 引起的肺部感染與多種細胞因子有關(guān)[10]。TNF-a 主要由活化的單核－巨噬細胞分泌，對中性粒細胞和巨噬細胞等炎癥細胞具有較強的趨化作用[11]。而IL-17A主要由Th17細胞分泌，通過誘導(dǎo)細胞因子、趨化因子和抗菌肽的表達來清除微生物感染。Bayes 等[12]研究表明，IL-17A 在PA 感染中能誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生并與之有協(xié)同作用，增強宿主的抗菌免疫應(yīng)答，但這種促炎作用的長期維持會導(dǎo)致慢性炎癥。本研究中，實驗組大鼠接種PA瓊脂糖包裹體后第1、第3、第5 天，大鼠肺、血清TNF-α、IL-17A含量逐漸上升，由此推測，PA 促進中性粒細胞和單核—巨噬細胞的募集和激活，分泌大量TNF-a、IL-17A，從而導(dǎo)致肺組織的急、慢性炎癥。這與本實驗病理觀察結(jié)果（接種后第1 天肺組織大量PMN 浸潤，第3、第5 天肺組織PMN 逐漸減少，單核巨噬細胞、淋巴細胞逐漸增多）相一致。

目前，PA肺部感染動物模型沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。動物接種PA常用的方式有經(jīng)皮氣管穿刺、噴霧[13-14]、滴鼻[15-16]和插管[17-18]等。經(jīng)皮氣管穿刺對實驗人員技術(shù)及設(shè)備要求較高，操作復(fù)雜；噴霧、滴鼻則不能準(zhǔn)確掌握動物感染菌量，且易造成實驗人員污染，成功率和安全性低；經(jīng)口插管易誤插食管，無法準(zhǔn)確判斷PA是否接種至肺部。本實驗建立的PA肺部感染動物模型具有以下特點：第一，使用可塑性更好、包裹效果更均勻的低熔點瓊脂糖包裹PA，不但有效地避免宿主的免疫反應(yīng)清除，還能夠形成持續(xù)的感染，更類似于臨床PA肺部感染狀況；第二，接種部位固定于左肺下葉深部，大鼠不易發(fā)生接種物倒流而窒息死亡，PA 瓊脂糖包裹體也不易被清除，從而保證接種量的穩(wěn)定，因此更易造成肺部感染，形成肺的局部感染病灶，有利于實驗結(jié)果觀察。

綜上所述，本實驗使用低熔點瓊脂糖包裹PA，通過氣管切開法將PA 瓊脂糖包裹體注入到大鼠肺部，可成功建立操作安全、死亡率低、重復(fù)性好的大鼠PA肺部感染模型。這對深入研究PA肺部感染的發(fā)病機制、宿主免疫反應(yīng)、PA耐藥機制和尋找、研發(fā)新藥具有重要意義。