徐 濤 ，劉 暢，李曉瑩，陳 芳，葛盈盈,3，薛春紅，李 鑫，張慶梅,3，謝小薰,3，羅 彬,3△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021）

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其90%以上為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[1-2]。目前，手術(shù)切除、放療和化療是治療HCC 的主要手段，由于術(shù)后殘余病灶復(fù)發(fā)、放化療抵抗，患者預(yù)后效果依舊不理想[3-4]，因此迫切需要探索新的輔助治療方法。近年來，基因靶向治療和免疫治療等顯示出良好的應(yīng)用前景，但治療靶點(diǎn)的選擇及其功能機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

癌－睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）是一類在多種腫瘤組織中表達(dá)，在除睪丸以外的正常組織中幾乎不表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，因而被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)[5]。OY-TES-1 是CTA 家族成員之一，又稱頂體素結(jié)合蛋白（acrosin binding protein，ACRBP）[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，OY-TES-1于包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)[7]。在HCC 細(xì)胞株中干擾OY-TES-1表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-9]。目前，OY-TES-1 影響HCC 惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)分析，探討OY-TES-1 潛在的生物學(xué)功能和可能參與的信號(hào)通路，從中篩選關(guān)鍵分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為探索HCC治療靶點(diǎn)的選擇及其功能機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 36例HCC 及配對(duì)癌旁正常組織，均來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)患者，組織離體后取材置于液氮保存，標(biāo)本于術(shù)后經(jīng)病理確診。標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意和廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞 人源HCC 細(xì)胞株BEL-7404、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，使用含10%胎牛血清（FBS，加拿大Wisent公司）的DMEM（加拿大Wisent公司）于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 生物信息學(xué)分析 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org/）篩選OY-TES-1 表達(dá)正相關(guān)基因集。DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）功能富集分析。GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）用于分析HCC 樣本中OY-TES-1和丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表達(dá)及表達(dá)相關(guān)性。

1.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） 采用RNA 提取試劑盒（南京諾唯贊公司，#RC101-01）提取標(biāo)本和細(xì)胞株RNA。分光光度計(jì)（北京天根公司）檢測RNA 濃度和吸光度值。cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊公司，#R323-01）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR 染料法行qPCR（南京諾唯贊公司，#Q711-02）檢測，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。Fold Change=2-△△Ct法分析結(jié)果數(shù)據(jù)。引物序列見表1，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM3000（美國Invitrogen 公司）轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA（陰性對(duì)照、OY-TES-1 siRNA）分別轉(zhuǎn)染至HCC 細(xì)胞，48h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。OY-TES-1 siRNA 序列（sense：5’-CGUGGAAGAGCUCCUAGAATT-3’；antisense：5’-UUGUAGGAGCUCUUCCACGTT-3’）由蘇州吉瑪公司合成。

1.6 Western blotting 依照蛋白提取試劑盒（北京索萊寶公司）操作說明提取細(xì)胞株總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白濃度檢測，樣品經(jīng)變性后上樣。依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影曝光。OY-TES-1 抗體（美國santa cruz 公司，#sc-390594）（1∶100 稀釋），PKM2 抗體（美國cell signaling公司，#4053）（1∶1 000稀釋），抗小鼠二抗（美國abcam公司，#ab6728）（1∶5 000稀釋）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，配對(duì)資料組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法；采用Spearman秩相關(guān)分析表達(dá)的相關(guān)性；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OY-TES-1可能影響HCC能量代謝相關(guān)通路 通過LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫查找371例HCC RNA-seq 測序數(shù)據(jù)，以表達(dá)相關(guān)系數(shù)大于0.3 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得1 001個(gè)與OY-TES-1表達(dá)正相關(guān)的基因集。對(duì)此基因集進(jìn)行GO 和KEGG 分析，結(jié)果顯示OY-TES-1 主要富集于多糖合成、脂代謝和碳水化合物代謝等細(xì)胞能量代謝相關(guān)通路，見圖1、圖2。隨后，在OY-TES-1 表達(dá)正相關(guān)的基因集中，尋找參與細(xì)胞能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，PKM2型基因成為潛在候選基因。

2.2 HCC中OY-TES-1和PKM2高表達(dá)且具有較強(qiáng)的表達(dá)相關(guān)性 利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對(duì)369例HCC和50例正常肝組織的RNA-seq 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：OY-TES-1 和PKM2 在HCC 中的表達(dá)均顯著高于正常肝組織，且兩者在HCC組織中表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.3，P＜0.001），見圖3。

為驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究收集36例HCC 及其配對(duì)癌旁組織行qPCR檢測，結(jié)果顯示：HCC組織中OY-TES-1（癌組織：0.58±0.95vs癌旁組織：0.36±0.61）（t=2.339，P＜0.05）和PKM2（癌組織：0.14±0.17vs癌旁組織：0.08±0.14）（t=2.622，P＜0.05）的表達(dá)都高于癌旁組織，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.482，P＜0.001），見圖4。

隨后，為了了解OY-TES-1 和PKM2 mRNA 表達(dá)與患者臨床參數(shù)的關(guān)系。以O(shè)Y-TES-1 和PKM2在36例HCC組織中mRNA 表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)（高于中位數(shù)為高表達(dá)組，否則為低表達(dá)組），對(duì)兩者的mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、WHO分級(jí)等臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尚未發(fā)現(xiàn)有顯著相關(guān)性，見表2。

圖1 OY-TES-1表達(dá)正相關(guān)基因集GO分析

圖2 OY-TES-1表達(dá)正相關(guān)基因集KEGG分析

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析HCC中OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達(dá)及表達(dá)相關(guān)性

圖4 qPCR檢測HCC中OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達(dá)及表達(dá)相關(guān)性

表2 OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的關(guān)系n

2.3 下調(diào)OY-TES-1表達(dá)對(duì)PKM2表達(dá)的影響 為篩選合適的細(xì)胞株進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，本研究通過qPCR和Western blot分別檢測HCC細(xì)胞株BEL-7404、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 中OY-TES-1 和PKM2 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：OY-TES-1 和PKM2在HepG2和BEL-7404中mRNA和蛋白表達(dá)相對(duì)較高，見圖5。因此，選擇這兩株細(xì)胞進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

將OY-TES-1 siRNA 轉(zhuǎn) 染HepG2 和BEL-7404細(xì)胞48 h 后進(jìn)行檢測，qPCR 結(jié)果顯示：OY-TES-1 mRNA表達(dá)量在HepG2和BEL-7404細(xì)胞中分別為0.69±0.06、0.62±0.07，下調(diào)至60%左右；PKM2 mRNA表達(dá)量在HepG2 和BEL-7404 細(xì)胞中分別為0.73±0.09、0.75±0.07，下調(diào)至70%左右。Western blot結(jié)果顯示：隨著OY-TES1-1 表達(dá)下調(diào)，兩株HCC 細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)也隨之明顯下調(diào)，見圖6。以上結(jié)果提示HCC 中OY-TES-1 對(duì)PKM2 表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

圖6 HCC細(xì)胞株中下調(diào)OY-TES-1影響PKM2的表達(dá)

3 討論

近年來，HCC的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年約有70萬例新發(fā)HCC患者，其中我國約占一半[10]，為此迫切需要尋找新的HCC 輔助治療靶點(diǎn)。目前一些CTA 疫苗（如NYESO-1、MAGE）已用于臨床試驗(yàn)階段并取得一定療效，顯示CTA具有臨床應(yīng)用前景[11]。OY-TES-1作為CTA 家族成員之一，前期研究發(fā)現(xiàn)OY-TES-1 具有免疫原性，在部分HCC患者血清中檢出抗OY-TES-1抗體[12]，但是OY-TES-1影響HCC惡性生物學(xué)行為的具體機(jī)制及調(diào)控分子目前還未見報(bào)道。

生物信息學(xué)是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展的新興學(xué)科，它通過對(duì)基因序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能信息進(jìn)行檢索和分析，為后繼實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo)。在本研究中，我們首先通過LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫中HCC 樣本的測序結(jié)果，獲得與OY-TES-1 表達(dá)顯著正相關(guān)的1 001 個(gè)基因集。隨后，通過DAVID 數(shù)據(jù)庫研究OY-TES-1 潛在的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)該基因主要富集于多糖合成、脂代謝和碳水化合物代謝等細(xì)胞能量代謝通路。結(jié)合LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，進(jìn)一步篩選出參與細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因PKM2。

PK是糖酵解途徑中三大關(guān)鍵限速酶之一，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸[13]，對(duì)細(xì)胞生長和增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用[14]。PK 包括L 型和M型，M型又分為M1和M2亞型。PKM2特異性表達(dá)于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，因此也被稱為腫瘤特異性丙酮酸激酶。研究發(fā)現(xiàn)，HCC 中高表達(dá)的PKM2能夠調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞能量代謝進(jìn)而影響HCC的惡性生物學(xué)行為[15]。為此推測，OY-TES-1 也可能通過PKM2 影響HCC 細(xì)胞能量代謝從而影響HCC 的惡性生物學(xué)行為。

為證實(shí)上述推測，本研究首先利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC組織中OY-TES-1 和PKM2 都呈高表達(dá)，兩者具有較強(qiáng)的表達(dá)相關(guān)性。隨后，收集36例HCC和配對(duì)癌旁組織進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示HCC組織中OY-TES-1 和PKM2 的表達(dá)都顯著高于癌旁組織，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)OY-TES-1 和PKM2的表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)有顯著相關(guān)性，可能與研究樣本數(shù)量偏少有關(guān)，仍有待進(jìn)一步探索。

本研究中，在HCC 細(xì)胞株HepG2 和BEL-7404中干擾OY-TES-1 的表達(dá)，結(jié)果顯示，PKM2 的mRNA 和蛋白表達(dá)也隨之下調(diào)。已知腫瘤細(xì)胞為了維持自身的生長和增殖，對(duì)葡萄糖的攝取遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞，更偏向于利用糖酵解途徑生成乳酸而取代正常細(xì)胞的有氧氧化，這種現(xiàn)象被稱為瓦博格效應(yīng)（warburg effect）[16]。已有研究表明，HCC 中PKM2 表達(dá)升高能夠促進(jìn)HCC 瓦博格效應(yīng)的發(fā)生[17]。本研究的實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)OY-TES-1 可影響PKM2的表達(dá)，但是OY-TES-1是否通過調(diào)節(jié)PKM2的表達(dá)從而影響HCC 細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致HCC瓦博格效應(yīng)的發(fā)生仍有待研究。