鐘桂玲，李文祥，王 賀，陳 豐，李仕來△，朱繼金△

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科；3.急診科，南寧 530021；2.山東大學齊魯醫(yī)學院，濟南 250012）

鐵死亡是細胞死亡的一種獨特的調節(jié)機制，由Dixon等[1]于2012年在《cell》雜志上首次提出。鐵死亡與其他形式的細胞死亡形式不同，它不依賴于caspase，典型特征是鐵依賴的脂質活性氧（ROS）的增加以及線粒體形態(tài)的改變。缺血性心臟病(ICM)多發(fā)生于冠心病的晚期階段，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點，再灌注治療目前仍然是治療ICM的唯一有效治療方法。缺血后再灌注治療，可以增加缺血心肌的血液供應，但會導致再灌注后心肌組織損傷和氧化應激升高而引起的心率失常[2]。鐵死亡參與許多疾病的病理生理過程，在腫瘤和多種器官發(fā)生缺血再灌注損傷（I/R）時廣泛存在[3]，尤其是心臟I/R[4]。核因子E2相關因子2（Nrf2）和谷胱甘肽過氧化物酶4（Gpx4）是鐵死亡的關鍵調節(jié)因子，Nrf2 及Gpx4的下調會引起細胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致胞內(nèi)ROS 增多，造成細胞死亡[5]。鐵死亡誘導劑RSL3 可通過抑制Gpx4 的表達導致脂質過氧化物及脂質ROS 的積累，進而引起H9C2 心肌細胞發(fā)生鐵死亡[6]。因此，可以通過升高Nrf2或Gpx4的蛋白表達來維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而抑制鐵死亡。

研究表明，親脂性抗氧化劑能夠抑制鐵依賴的脂質過氧化物及脂質ROS 的積累，包括維生素E、Ferrostatin-1、Liproxstatin-1 和可能有效的生物活性多酚[7]。普羅布考（probucol）是一種有效的抗氧化劑，臨床上用于降低血清膽固醇，根據(jù)probucol的這些特點，本研究旨在探討probucol抑制RSL3誘導的H9C2心肌細胞鐵死亡的有效性及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑 H9C2大鼠心肌細胞購于武漢普諾賽生物技術有限公司，probucol（sellck S2119），RSL3（sellck S8155），澳洲胎牛血清FBS（HyClone 30087.02），DMEM 培養(yǎng)基（HyClone SH30243），CCK8 試劑盒（碧云天），ROS 檢測試劑盒（碧云天S0033S），Anti-Gpx4 antibody（Abcamab125066 1 ∶10 000），Anti-Nrf2 antibody（Abcamab92946 1 ∶1 000），Anti-GAPDH antibody（CST2118S 1∶1 000），Anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody（CST 7074S 1∶3 000）。

1.2 細胞培養(yǎng) 將H9C2心肌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素－鏈霉素溶液的高糖DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)，放入5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育。每天觀察細胞的數(shù)量與形態(tài)，當細胞增殖至合適數(shù)量時，進行細胞傳代。

1.3 實驗分組和細胞活性檢測 測定RSL3的半數(shù)抑制濃度（IC50）：將對數(shù)生長期的H9C2 細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞。鋪板24 h后，每組設置3 個復孔，設9組，分別為DMSO組、RSL3（0.195 μmol/L、0.39 μmol/L、0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L）組，加RSL3后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用多通道移液器吸走舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有10 μL CCK8 溶液的培養(yǎng)基。放入5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定OD 值，通過GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，測定RSL3 的IC50。摸索probucol的最佳干預濃度，同上方法細胞鋪板后24 h，設10組，分別為DMSO組、RSL3（IC50）組、RSL3（IC50)+probucol（0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.13 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）組。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，用同樣的方法測定細胞活性，篩選出probucol 的最佳干預濃度。使用RSL3的IC50和probucol的最佳干預濃度，處于對數(shù)生長期的H9C2 心肌細胞隨機分為 4組：對照組（DMSO組）、RSL3（IC50）組、RSL3（IC50）+probucol（最佳干預濃度）組、probucol（最佳干預濃度）組。

1.4 細胞內(nèi)ROS流式檢測 將對數(shù)生長期的H9C2細胞接種于6孔板中，每孔5×105個細胞，每組設置3個復孔，接種24 h 后加入RSL3 與probucol 共處理，培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征。吸掉原來培養(yǎng)基，PBS 清 洗1 次，加 入10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針，37 ℃孵育20 min，棄去上清，用不含EDTA的胰酶把細胞消化下來轉移到離心管中，1 000 g，4 ℃離心5 min，棄上清，PBS 清洗2 次，最后用PBS 重懸，放入冰盒避光，利用流式細胞儀定量ROS水平。

1.5 Western blotting 試驗檢測各蛋白含量 RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑（PMSF）按100∶1 的體積配置細胞裂解液，隨后將裂解液加入6 孔板中以充分裂解細胞。蛋白樣品用10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉膜完成后，將PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中，常溫下封閉1 h。然后，加入一抗（Anti-GAPDH antibody，1∶1 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜?；厥找豢?，用TBST 清洗3 次，5 min/次。常溫下二抗（Anti-rabbit IgG,HRP-linked antibody，1∶3 000）孵育1 h，用TBST 清洗3 次，8 min/次。將配制的ECL 化學發(fā)光液滴至PVDF 膜表面，于凝膠成像分析系統(tǒng)中曝光及采集圖像。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，進一步采用Bonferroni 法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 probucol抑制RSL3誘導的H9C2心肌細胞鐵死亡 用濃度梯度的RSL3處理H9C2心肌細胞12 h，根據(jù)細胞活性結果，計算出RSL3 的IC50 為1.406 μmol/L（圖1A）。DMSO組、RSL3（IC50）組、RSL3（IC50)+probucol（0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.13 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）組的細胞存活率分別為（100±4.21）%、（45.63±3.11）%、（40.69±2.68）%、（42.72±6.30）%、（52.71±3.41）%、（58.81±2.62）%、（75.74±2.16）%、（90.74±3.38）%、（96.95±2.61）%、（97.45±4.57）%。當probucol 濃度為50 μmol/L 時，與DMSO組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1B、圖1C。因此，probucol 的最佳干預濃度為50 μmol/L。

圖1 CCK8檢測H9C2大鼠心肌細胞活性

2.2 probucol改善H9C2細胞形態(tài)結構 光鏡下觀察細胞形態(tài)，DMSO組細胞形態(tài)呈梭型，長勢良好，貼壁性好，折光度強；RSL3組的細胞皺縮、貼壁性差，折光度減弱；RSL3+probucol組細胞狀態(tài)明顯改善，與DMSO組細胞形態(tài)基本相似；與DMSO組相比，probucol組的細胞形態(tài)無明顯變化，見圖2。

2.3 probucol 降低胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生 DMSO組和probucol組細胞內(nèi)的ROS 濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與DMSO組比較，RSL3組細胞內(nèi)ROS 升高（P＜0.05）；與RSL3組比較，RSL3+probucol組細胞內(nèi)ROS 明顯下降（P＜0.05）。結果表明，probucol 可降低細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，減輕細胞內(nèi)氧化應激反應（表1、圖3）。

2.4 probucol通過升高Nrf2、Gpx4蛋白水平保護心肌細胞免受RSL3 誘導的鐵死亡 與DMSO組相比，RSL3組Nrf2和Gpx4蛋白的表達降低，probucol組Gpx4 蛋白的表達升高（P＜0.05）；與RSL3組相比，RSL3+probucol組Nrf2、Gpx4 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05）。值得注意的是，單加probucol也能升高細胞內(nèi)的Gpx4蛋白的表達水平，見圖4。

圖2 光鏡下觀察H9C2大鼠心肌細胞形態(tài)（100×）

表1 probucol治療后各組細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況 %，

表1 probucol治療后各組細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況 %，

與DMSO組比較，**P＜0.001；與RSL3+probucol組比較，##P＜0.001；與probucol組比較，△△P＜0.001，△P＜0.05。

圖3 流式細胞儀檢測H9C2大鼠心肌細胞ROS的含量

圖4 各組Nrf2、Gpx4的蛋白表達情況

3 討論

心肌I/R指部分或完全阻塞的冠狀動脈重新獲得再通時，缺血心肌恢復正常灌注，但其組織損傷反而呈進行性加重的病理過程。經(jīng)典的I/R損傷發(fā)生了離子堆積、線粒體膜損傷、ROS形成、內(nèi)皮功能障礙、血小板聚集、免疫激活、細胞凋亡和自噬等多種病理生理過程，這些病理過程導致心肌組織的結構和功能發(fā)生改變[8-9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在I/R中也發(fā)揮著重要作用，Baba等[10]首次證實在活體I/R期間，心肌細胞和非心肌細胞發(fā)生鐵死亡，抑制I/R期間心肌細胞反生鐵死亡，可以有效的減少梗死面積和心肌損傷的血清標記物，改善心臟重構[9]。

鐵死亡在形態(tài)、生化、基因表達方面不同于傳統(tǒng)的凋亡、壞死、自噬。鐵死亡的形態(tài)特征為線粒體縮小、膜密度增高及線粒體嵴減少或消失，分子特征為細胞內(nèi)的鐵過載及脂質ROS 的積累[1,11]。目前，鐵死亡發(fā)生機制涉及鐵代謝、脂質代謝及System Xc--GSH-GPX4等抗氧化途徑，各途徑之間的失衡會破壞胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生過量的脂質過氧化物及脂質ROS，從而誘發(fā)鐵死亡[12]。RSL3是一種鐵死亡誘導劑，可直接抑制Gpx4表達，降低Gpx4含量，導致大量的脂質過氧化物和ROS 產(chǎn)生，從而引起細胞鐵死亡[13]。因此，本研究采用了RSL3誘導H9C2大鼠心肌細胞發(fā)生鐵死亡的體外模型。

probucol是一種有效的抗氧化劑，從結構上看，probucol 有14 個親脂性甲基且結構對稱，具有強脂溶性的特點，可以有效穿越細胞膜進入胞內(nèi)。分子中的2 個抗氧化活性基團－酚羥基，不僅抗氧化能力強，而且與自由基結合后形成不可逆的聯(lián)苯醌可以有效的抗脂質氧化[14]。probucol 作為一種成熟的臨床用藥，多年來被用作抗動脈粥樣硬化藥物[15-16]，表現(xiàn)出良好的安全性，有利于新適應證的臨床轉化。最近，有人研究probucol 的類似物RC363 和RC574 能夠有效的抑制鐵死亡，低劑量（3 μmol/L）的probucol在HT22細胞中無法抵抗鐵死亡，但可以顯著增加GPX 酶活性以及小幅度的增加GPX1 的含量[17]，不影響脂蛋白譜并保護低密度脂蛋白的氧化修飾，且抑制脂質過氧化[16]。在本研究中，低劑量的probucol無法抑制RSL3誘導的鐵死亡，但是隨著probucol 濃度的增加，H9C2 心肌細胞的活性也增加，當probucol 濃度為50 μmol/L 時，細胞形態(tài)顯著改善。且單獨給予H9C2 心肌細胞probucol 處理時并不影響細胞形態(tài)。在RSL3 處理中同時加入probucol治療可以減少H9C2心肌細胞中ROS的產(chǎn)生，減輕細胞內(nèi)的氧化應激，這與先前的研究結果一致，probucol能有效的抗氧化[16,18]。

Zhou 等[19]的研究表明，probucol 可以通過激活Nrf2 信號通路，抑制脊髓損傷后的氧化應激，抑制細胞凋亡。研究顯示，probucol 可以抑制高糖條件下細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，提示probucol 可能通過上調Nrf2 減輕糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性[18,20]。Nrf2 是一種轉錄調節(jié)因子，到目前為止，幾乎所有與鐵死亡相關的基因都直接或間接受到Nrf2的轉錄調控，包括谷胱甘肽調節(jié)基因、NADPH 的生成以及鐵調節(jié)基因[21]，已被證明在ICM 的治療和鐵死亡的調節(jié)中起關鍵作用[22-23]。Gpx4 是Nrf2 的下游靶點，許多完整的谷胱甘肽合成和代謝相關酶都在Nrf2 的調控下，包括谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLC/GCLM)的催化和調節(jié)亞基(GCLC/GCLM)、谷胱甘肽合成酶(GSS)和胱氨酸/谷氨酸轉運體XCT(SLC7A11)的一個亞基。此外，許多Nrf2靶基因參與阻止脂質過氧化的形成和鐵死亡的進展，以及一些參與Nrf2信號通路的蛋白本身也是脂質過氧化的直接靶點[24]。本研究結果顯示，50 μmol/L 的probucol 可以保護H9C2 大鼠心肌細胞免受RSL3 誘導的鐵死亡，probucol 可以升高RSL3 處理后的Gpx4 蛋白水平（P＜0.05），這可能是probucol 通過Nrf2 信號通路影響Gpx4 的水平保護心肌細胞。而且單獨給予probucol 也能增加H9C2 細胞內(nèi)的Gpx4 蛋白水平，這是否使probucol 能成為心?；颊叩念A防用藥，增強機體的抗氧化能力，值得進一步研究。

綜上所述，probucol 可能通過上調Nrf2、Gpx4的表達來拯救H9C2 心肌細胞的細胞活性，降低細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，從而減低細胞氧化應激，提高其自身的抗氧化能力。然而，鐵死亡在心臟I/R 中是多環(huán)節(jié)構成、多因素參與的復雜過程，probucol是否存在其他方面的機制抑制鐵死亡，有待進一步研究。