趙玉華 ，李俊瑩，王春苗，翟利娜，李欣曉，侯華新，黎丹戎,△

（廣西醫(yī)科大學(xué)1.腫瘤醫(yī)學(xué)院；2.藥學(xué)院；3.生命科學(xué)院，南寧 530021）

卵巢癌是婦科腫瘤中發(fā)病率和病死率均較高的一類腫瘤，預(yù)后差，5年生存率不到30%[1]。卵巢癌高病死率的重要原因是化療耐藥，順鉑是卵巢癌臨床治療的一線藥物，然而順鉑耐藥的發(fā)生給卵巢癌患者的治療帶來了極大挑戰(zhàn)[2]。因此，尋找治療卵巢癌順鉑耐藥的新型化合物，提高卵巢癌臨床化療效果迫在眉睫。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)的一種生理反應(yīng)，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以保護(hù)細(xì)胞，而持續(xù)嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張、腫脹而觀察到細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種腫瘤中可被高度誘導(dǎo)，且與腫瘤細(xì)胞生存和抗癌治療耐藥相關(guān)[5-6]。新近研究指出，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥[7]。但目前尚缺乏調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與人卵巢癌順鉑耐藥發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究。本課題組前期合成的系列大黃酸衍生物，其中衍生物4B作用順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞胞漿廣泛空泡化，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。為進(jìn)一步明確大黃酸衍生物4B 殺傷順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞是否與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否能作為克服順鉑耐藥卵巢癌的治療方式，本研究以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 和耐藥株SKOV3/DDP 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討大黃酸衍生物4B 對(duì)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控及抑制卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制，以期為順鉑耐藥卵巢癌的治療提供新思路和候選藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP、正常卵巢細(xì)胞株IOSE80 均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，由廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院傳代保存。

1.2 藥物和主要試劑 大黃酸衍生物4B[1,8-二芐氧基-9，10-蒽醌-N-（2-二甲胺基）乙基-3-甲酰胺，純度＞98%]，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。一抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類蛋白激酶（PERK）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）及熒光二抗單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、離心，以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h。加藥組為含有不同濃度（0～16 μmol/L）的大黃酸衍生物4B的培養(yǎng)基，空白組為體積相同的完全培養(yǎng)基，設(shè)置溶劑對(duì)照孔（0.1%DMSO）。藥物作用48 h后，每孔加入20 μL的MTT，孵育4 h后，棄去孔板中液體，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO）。振搖10 min 后，用酶標(biāo)儀（SynergyH1,美國BioTek公司）檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（加藥組OD值－溶劑對(duì)照孔OD 值)/空白組OD 值×100%。根據(jù)所得OD值計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、離心，用大黃酸衍生物4B 處理SKOV3 和SKOV3/DDP 細(xì)胞48 h，根據(jù)MTT 結(jié)果確定分組藥物濃度，分為對(duì)照組、4B 2 μmol/L組、4B 6 μmol/L組和順鉑20 μmol/L組。收集上清及消化細(xì)胞，用PBS 洗滌兩次，并懸浮于100 μL 結(jié)合緩沖液，然后加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD（BD Biosciences，USA），室溫下避光孵育15 min。添加300 μL 結(jié)合緩沖液稀釋樣品。使用BD FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀、Cellquest軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 蘇木精－伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 將8×104個(gè)/mL 細(xì)胞懸液接種到已放有高壓滅菌蓋玻片的6孔板中，每孔2 mL，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入2 μmol/L 衍生物4B 和不同濃度順鉑（SKOV3 5 μmol/L，SKOV3/DDP 20 μmol/L）處理細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組（不加藥物），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。依次用蘇木精、伊紅染色，晾干，封片。光學(xué)顯微鏡下(EVOS FL Auto，美國Life technologies 公司)觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的改變并拍照記錄。

1.6 ER-Tracker Red觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、離心后接種于共聚焦皿中，待細(xì)胞貼壁24 h，加入含大黃酸衍生物4B 2 μmol/L的培養(yǎng)基2 mL，48 h后棄上清，用配置好的ER-Tracker Red 預(yù)制液置于孵育箱孵育10 min，加入Hochest33342 染色孵育10 min，用HBSS（Ca2+&Mg2+）洗3 次，PBS 洗3 次，棄去緩沖液，加無血清培養(yǎng)基，激光共聚焦掃描顯微鏡（SP8，德國Leica 公司）下觀察、拍照、記錄。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá) 4 μmol/L大黃酸衍生物4B分別作用于SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞不同時(shí)間（0 h、12 h、24 h、48 h）后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 定量，取30 μg 蛋白樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，含5%脫脂牛奶的PBST 孵育1 h，一抗GRP78（1∶1 000）、PERK（1∶1 000）、βactin（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，熒光二抗（1:15 000）室溫避光孵育1 h。使用Odyssey紅外掃膜儀（CXL，美國LI-COR公司）掃描蛋白條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。

1.8 觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA 對(duì)細(xì)胞空泡及存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 和SKOV3/DDP細(xì)胞，消化、離心，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，用不同濃度（0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA 預(yù)處理2 h，加入不同濃度的大黃酸衍生物4B（0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L）處理細(xì)胞。連續(xù)觀察拍攝明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。藥物作用48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率（方法同1.3）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸衍生物4B對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

SKOV3、SKOV3/DDP、IOSE80 的IC50分別為（3.68±0.71）μmol/L、（3.54±0.37）μmol/L、（5.00±0.18）μmol/L。大黃酸衍生物4B 對(duì)SKOV3、SKOV3/DDP 的抑制作用明顯強(qiáng)于卵巢正常細(xì)胞IOSE80（P＜0.05），說明衍生物4B 對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有一定程度的選擇性殺傷作用。

2.2 細(xì)胞凋亡 在流式散點(diǎn)圖中，右下（lower right，LR）象限表示早期凋亡細(xì)胞，右上（upper right，UR）象限表示中晚期凋亡細(xì)胞，LR+UR 為總凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示：經(jīng)2 μmol/L、6 μmol/L 4B 及20 μmol/L 順鉑作用SKOV3 和SKOV3/DDP 細(xì) 胞48 h 后，隨著大黃酸衍生物4B 濃度的升高，凋亡率升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性。藥物處理組的總凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），相同濃度順鉑作用兩株細(xì)胞后，SKOV3 細(xì)胞凋亡率明顯高于SKOV3/DDP 細(xì)胞，表明耐藥株確實(shí)存在順鉑耐藥。在SKOV3/DDP 細(xì)胞中，大黃酸衍生物4B 在6 μmol/L時(shí)凋亡率高于順鉑20 μmol/L（P＜0.01），且細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性升高，見圖1。

2.3 HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下可見對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)豐富，染色質(zhì)分布均勻，呈紅色均染；順鉑處理后，視野中細(xì)胞數(shù)減少，胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞變細(xì)長(zhǎng)；衍生物4B處理后，細(xì)胞呈不規(guī)則形狀和皺縮，不同的是，衍生物4B 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)空泡的形成，空泡主要分布于細(xì)胞核周邊，染色質(zhì)固縮，另外在SKOV3/DDP細(xì)胞中衍生物4B引起的空泡明顯多于SKOV3細(xì)胞，見圖2。

2.4 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化 ER-Tracker Red染色結(jié)果顯示：SKOV3、SKOV3/DDP對(duì)照組細(xì)胞中（紅色）空泡均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核完整。而當(dāng)衍生物4B作用48 h 后細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡（分布于細(xì)胞核周圍），且空泡被ER-Tracker Red 標(biāo)記特異性包圍，見圖3，表明衍生物4B 誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖1 衍生物4B對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖2 細(xì)胞HE染色圖（×400）

圖3 ER-Tracker Red染色定位細(xì)胞空泡來源（×630）

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0 h）相比，大黃酸衍生物4B處理后SKOV3 和SKOV3/DDP 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78 和PERK 的表達(dá)明顯上調(diào)（均P＜0.05）；對(duì)于SKOV3/DDP 細(xì)胞，大黃酸衍生物4B 作用24 h時(shí)GRP78上調(diào)明顯；對(duì)于SKOV3細(xì)胞，大黃酸衍生物4B 作用48 h 時(shí)GRP78 的表達(dá)明顯增加，見圖4。

2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA對(duì)衍生物4B誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響 用0.5 μmol/L 的4-PBA預(yù)處理2 h后，加入衍生物4B 2 μmol/L作用24 h后，光鏡下可見在4B藥物濃度相同的情況下，加入抑制劑組的細(xì)胞空泡比不加抑制劑組的明顯減少，光鏡圖如圖5A所示。MTT結(jié)果測(cè)得4-PBA可有效降低衍生物4B 對(duì)SKOV3 和SKOV3/DDP 的細(xì)胞增殖的抑制作用，使細(xì)胞存活率提高，結(jié)果如圖5B所示。

圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78及PERK蛋白表達(dá)

圖5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA處理后對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生存率影響

3 討論

順鉑作為卵巢癌化療的經(jīng)典藥物因其效果明確、價(jià)格低廉而廣泛應(yīng)用。但糟糕的是，70%的晚期患者經(jīng)一段時(shí)間治療，順鉑療效下降甚至消失，2年內(nèi)發(fā)生局部復(fù)發(fā)并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。卵巢癌的順鉑耐藥是導(dǎo)致其高死亡率的主要原因之一，腫瘤發(fā)生耐藥后，尋找新的對(duì)耐藥細(xì)胞敏感的藥物或通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，對(duì)腫瘤的有效控制和治療至關(guān)重要。本研究通過檢測(cè)衍生物4B 對(duì)卵巢癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50發(fā)現(xiàn)，衍生物4B 對(duì)SKOV3 和SKOV3/DDP 均具有很好抗腫瘤活性，值得注意的是，其對(duì)正常卵巢細(xì)胞(IOSE80)的IC50相對(duì)較高（P＜0.05），表明衍生物4B 對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有一定的選擇性。隨后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，隨著衍生物4B濃度升高，兩株細(xì)胞的凋亡率均呈濃度依賴性增加，表明無論是卵巢癌細(xì)胞還是順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞均對(duì)衍生物4B敏感。

Qi 等[9]報(bào)道，環(huán)匹羅司可通過激活PERK 依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡并克服結(jié)直腸癌耐藥。Kong 等[10]發(fā)現(xiàn)miR-512-3p 通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以改善視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞順鉑耐藥的抵抗力?？梢?，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是腫瘤耐藥治療的新方式。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病理變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病理改變實(shí)質(zhì)上為水樣變性，主要是細(xì)胞內(nèi)水分的流失，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的濃縮，最后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔可擴(kuò)大從而形成空泡。ER-Tracker Red 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針，可用于活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性染色[11]。本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，衍生物4B 作用細(xì)胞后最明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變就是引起細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡。因此，為確定衍生物4B作用細(xì)胞時(shí)引起的胞質(zhì)空泡來源，本研究采用ER-Tracker Red 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行了標(biāo)記染色，發(fā)現(xiàn)衍生物4B 誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡可被ERTracker Red 包圍，表明空泡來源于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，衍生物4B可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶，可幫助蛋白質(zhì)正確折疊[12]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)GRP78 合成會(huì)增強(qiáng)，表達(dá)明顯增加，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白折疊以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。類蛋白激酶PERK 是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，可偶聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)，從而抑制翻譯[14-15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)增強(qiáng)PERK 活性，使其表達(dá)增加[16]。當(dāng)人體處于生理狀態(tài)時(shí)，PERK 與GRP78 以無活性的復(fù)合物形式存在。在應(yīng)激狀態(tài)下,PERK 會(huì)與GRP78 分離，GRP78會(huì)結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白[17]。本研究通過Western blotting 檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、PERK的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生物4B可明顯上調(diào)細(xì)胞GRP78、PERK 的表達(dá)（均P＜0.05），進(jìn)一步明確了衍生物4B 作用于細(xì)胞后激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時(shí)，通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA[18]處理發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA不僅能有效減少空泡的產(chǎn)生，而且能逆轉(zhuǎn)衍生物4B引起的細(xì)胞死亡。推測(cè)衍生物4B 是通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路抑制卵巢癌及順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或可逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥，成為卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥治療的一個(gè)新方向[19]。然而，本研究仍具有一定的局限性，衍生物4B 可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但其具體通過哪條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路對(duì)卵巢癌順鉑耐藥敏感及藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。