程青麗，劉文穎，趙曉涵，谷瑞增，李國(guó)明*，魯軍*

中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

食品是人類很直接、很重要的消費(fèi)品。食品安全直接關(guān)系著人民群眾的身體健康和生活質(zhì)量，關(guān)系著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定，已成為世界性關(guān)注的問(wèn)題[1]，食品過(guò)敏引發(fā)的疾病也逐漸成為人們關(guān)注的一個(gè)全球化公共安全問(wèn)題。

隨著工業(yè)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們的食品種類和飲食習(xí)慣發(fā)生了翻天覆地的改變，因食物而導(dǎo)致過(guò)敏的人數(shù)也日趨增多，最終影響到人們的生活品質(zhì)和生命安全。據(jù)資料顯示，在全世界約有5%～8%的兒童和2%～3%的成人患有食物過(guò)敏疾病，其中90%以上的食物過(guò)敏原來(lái)自八大類食物，分別為花生、小麥、大豆、堅(jiān)果類、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類等[2]，另外還存在其他160種食物也可引起過(guò)敏反應(yīng)。經(jīng)初步調(diào)查[3]，約有76%的過(guò)敏反應(yīng)是由以上8種常見(jiàn)致敏食品引起的，其中對(duì)花生、大豆、小麥和堅(jiān)果過(guò)敏的人數(shù)較少，其總和僅占自訴過(guò)敏總?cè)藬?shù)的6%。

食品在加工處理過(guò)程中還有可能產(chǎn)生新的過(guò)敏原，例如有人對(duì)魚類不過(guò)敏而對(duì)魚罐頭過(guò)敏，其原因可能是加工過(guò)程添加的食品添加劑成為新的過(guò)敏原。食品添加劑包括防腐劑、色素、抗氧化劑、香料、乳化劑、穩(wěn)定劑、松軟劑和保濕劑等，其中以人工色素、香料引起過(guò)敏反應(yīng)較為常見(jiàn)。為了延長(zhǎng)食品的貨架期、改善感官性狀和口感，這些化學(xué)物質(zhì)被廣泛用于各類食品中，但由于食品標(biāo)簽中標(biāo)注不明確或沒(méi)有標(biāo)注，如果不特別注意往往難以覺(jué)察[4]。食物過(guò)敏是導(dǎo)致多種急性癥狀的重要原因，例如皮膚、腸道及呼吸道疾病等[5]。食物過(guò)敏的一般癥狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應(yīng)及呼吸道癥狀，嚴(yán)重情況下甚至?xí)霈F(xiàn)系統(tǒng)性過(guò)敏性休克[6]。

一般引起人體過(guò)敏反應(yīng)的水產(chǎn)品主要是有殼水生動(dòng)物，其主要包括以蝦、蟹為代表的甲殼類動(dòng)物和以貝類為主的軟體動(dòng)物，其中蝦是最廣泛報(bào)道的水產(chǎn)過(guò)敏食物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者對(duì)甲殼類過(guò)敏原進(jìn)行了大量研究，尤其是針對(duì)蝦中的主要過(guò)敏原36 kD原肌球蛋白（Tropomysin，TM）的研究最為透徹，現(xiàn)已證明原肌球蛋白是蝦中致敏性最強(qiáng)的過(guò)敏原[7]。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶（Arginine kinase，ATP：精氨酸N-磷酸轉(zhuǎn)移酶，EC 2.7.3.3）被鑒定為水產(chǎn)品甲殼類食物中的新型過(guò)敏原，精氨酸激酶是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝最重要的酶之一，在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)能量產(chǎn)生較多時(shí)即機(jī)體催化精氨酸與ATP之間磷酸基團(tuán)的可逆性交換，生成磷酸精氨酸和ADP兩種產(chǎn)物。在細(xì)胞活動(dòng)爆發(fā)，需要能量的過(guò)程中磷酸精氨酸中的高能磷酸鍵在精氨酸激酶的作用下被轉(zhuǎn)移形成ATP。

1 水產(chǎn)品過(guò)敏

1.1 水產(chǎn)品過(guò)敏原

常見(jiàn)的水產(chǎn)品過(guò)敏原主要來(lái)自魚類、甲殼類和軟體類，其中魚類和甲殼類被FAO列入八大類過(guò)敏食物。不同的水產(chǎn)品其致敏原不相同，有的只含有一種，有的含有多種。迄今為止，已經(jīng)鑒定出6種甲殼類動(dòng)物過(guò)敏原，包括原肌球蛋白（Tropomyosin）、精氨酸激酶，肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain）、肌鈣蛋C（Troponin C）、肌漿鈣結(jié)合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein）和磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose phosphate isomerase），其中原肌球蛋白存在于章魚、扇貝等軟體動(dòng)物及甲殼類肌原纖維中的主要過(guò)敏原，其空間結(jié)構(gòu)是兩個(gè)呈α螺旋的亞基相互纏繞成超螺旋結(jié)構(gòu)，具有很高的熱穩(wěn)定性，并且不同物種間的TM存在著免疫交叉反應(yīng)[8-10]，TM是研究比較深入的甲殼類動(dòng)物主要過(guò)敏原，而AK是存在于甲殼類動(dòng)物中僅次于原肌球蛋白的另一重要過(guò)敏原，但是相關(guān)研究極少且不深入。AK可引發(fā)包括皮膚病態(tài)反應(yīng)，消化道、呼吸道和心血管系統(tǒng)功能混亂等癥狀在內(nèi)的過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至可能導(dǎo)致患者休克或死亡。

1.2 水產(chǎn)品過(guò)敏機(jī)制

作為日常食品中重要的一員，水產(chǎn)品因其具有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)且味道鮮美深受人們的喜愛(ài)。但隨著甲殼類水產(chǎn)品消費(fèi)量的增多，越來(lái)越多人在享受鮮美水產(chǎn)品的同時(shí)卻也受到過(guò)敏問(wèn)題的困擾，國(guó)內(nèi)有關(guān)調(diào)查顯示，有5%的兒童和2%的成年人會(huì)對(duì)某些水產(chǎn)品產(chǎn)生過(guò)敏。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全中心的調(diào)查也表明，水產(chǎn)品是我國(guó)食品中最主要的過(guò)敏原[11]，并且其比例還在上漲。

水產(chǎn)品過(guò)敏大都是由IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起的即時(shí)型過(guò)敏[12]。陳紅兵等[13]表示，食物過(guò)敏引起的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)包括食物過(guò)敏原的致敏階段、激發(fā)階段和效應(yīng)階段。在致敏階段，機(jī)體接觸過(guò)敏性食物后，產(chǎn)生反應(yīng)性IgE抗體。在嬰幼兒時(shí)期，由于胃腸道尚不健全，通透性高，食物中的過(guò)敏原進(jìn)入到體液中，可以選擇性誘導(dǎo)抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體應(yīng)答，然后IgE抗體的Fc段與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合完成致敏過(guò)程。在正常狀態(tài)下的人群，對(duì)從呼吸道吸入和通過(guò)胃腸道攝入的過(guò)敏原可以產(chǎn)生免疫耐受。對(duì)于過(guò)敏體質(zhì)的人群，通過(guò)這些途徑進(jìn)入的過(guò)敏原則可使機(jī)體處于致敏階段。在激發(fā)階段，相同的抗原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，通過(guò)與致敏肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞表面IgE抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯、前列腺素及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等大量生物活性介質(zhì)，作用于效應(yīng)組織和器官，引起局部或全身過(guò)敏反應(yīng)。

2 精氨酸激酶的分子特性

2.1 精氨酸激酶的分子結(jié)構(gòu)

在無(wú)脊椎動(dòng)物中，雖然不同來(lái)源的精氨酸激酶都可以催化精氨酸和三磷酸腺苷（ATP）的可逆反應(yīng)，但是這些精氨酸激酶在分子結(jié)構(gòu)上卻有著很大的區(qū)別。根據(jù)精氨酸激酶的分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)，可分為：1）單亞基精氨酸激酶，是其存在的主要形式，如海灣對(duì)蝦（Penaeus aztecus），一般由約360個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量40 kDa左右；2）雙亞基精氨酸激酶，如海參（Stichopus japonicus），某些雙亞基精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)與肌酸激酶相似，分子質(zhì)量約80 kDa；3）四亞基精氨酸激酶，如環(huán)節(jié)動(dòng)物，其分子質(zhì)量約在150～160 kDa之間[14]。研究表明，精氨酸激酶由N端結(jié)構(gòu)域（1～111）和C端結(jié)構(gòu)域（112～357）組成。有兩個(gè)分別位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的高度保守的環(huán)，環(huán)63～68和環(huán)309～318。N端結(jié)構(gòu)域全為α螺旋，C端結(jié)構(gòu)域?yàn)?個(gè)α螺旋圍繞著的8股反向平行β折疊結(jié)構(gòu)[15-16]，研究表明精氨酸和磷酸精氨酸主要位于的N端結(jié)構(gòu)域，但是精氨酸激酶的活性部位位于C端末端[17]。

2.2 精氨酸激酶的活性位點(diǎn)

AK由一個(gè)較大的C端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較小N端結(jié)構(gòu)域組成，底物類似物結(jié)合形成的過(guò)渡態(tài)晶體結(jié)構(gòu)顯示，底物的結(jié)合位點(diǎn)是處在C結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)之間。N端與C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是通過(guò)其邊緣的氨基酸殘基相互作用結(jié)合在一起維持AK結(jié)構(gòu)及功能的完整性。

一般來(lái)說(shuō)，精氨酸激酶的活性中心都具有（CPTNLGT）氨基酸殘基序列[18]。在太平洋牡蠣（Crassotrea gigas）中，精氨酸激酶中有高度保守的一對(duì)氨基酸殘基（D62和R193），它們形成一個(gè)離子對(duì)，將其替換掉會(huì)造成精氨酸激酶活性的大量喪失，其可能與調(diào)節(jié)底物與精氨酸激酶的結(jié)合有關(guān)[19-20]。

在海參的研究中，N-末端序列的缺失，將顯著影響精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性[21]。在雙亞基精氨酸激酶中，Trp-218位于精氨酸激酶的酶活性位點(diǎn)，將其突變?yōu)楸彼岷?，其酶活基本喪失。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)精氨酸激酶在構(gòu)象的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。Trp-208沒(méi)有位于精氨酸激酶的酶活性位點(diǎn)，其可能有助于維持催化過(guò)程中二聚體構(gòu)象的穩(wěn)定性。將其突變?yōu)楸彼岷螅涿富钕陆抵猎瓉?lái)的70.3%，使酶易于受到熱變性的影響。此外，Trp-208可能也在蛋白正確折疊方面發(fā)揮重要的作用[22]。

3 精氨酸激酶致敏性

3.1 精氨酸激酶的免疫交叉反應(yīng)

目前，國(guó)內(nèi)外研究主要集中在海洋魚、蝦、蟹的主要過(guò)敏原原肌球蛋白，對(duì)于精氨酸激酶的研究較少。AK是甲殼類動(dòng)物中僅次于原肌球蛋白的又一重要過(guò)敏原，其分子質(zhì)量約為40 kDa。Yu等[23]在利用蛋白組學(xué)的方法評(píng)價(jià)斑節(jié)對(duì)蝦的致敏性時(shí)發(fā)現(xiàn)除原肌球蛋白外，另一個(gè)分子質(zhì)量為40 kDa，等電點(diǎn)為6.5的蛋白也具有很好的IgE結(jié)合活性，此后他們證實(shí)這個(gè)蛋白為AK，并且與其他物種的AK具有很好的序列相似性。Rahman等[24]發(fā)現(xiàn)大西洋雪蟹AK能夠與甲殼類過(guò)敏患者血清反應(yīng)。Ayuso等[25]發(fā)現(xiàn)章魚AK同樣具有與甲殼類過(guò)敏患者血清的IgE結(jié)合活性，且章魚AK能夠明顯抑制蟹AK的IgE結(jié)合活性，因此證實(shí)AK在軟體類動(dòng)物和甲殼類動(dòng)物中存在交叉反應(yīng)。Liu等[26]通過(guò)BALb/c小鼠建立了擬穴青蟹AK的動(dòng)物過(guò)敏模型，證明了AK對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致敏性。此外凡納濱對(duì)蝦和擬穴青蟹等物種中的AK也先后被鑒定為重要過(guò)敏原[27-28]，AK已被證實(shí)是存在于甲殼類動(dòng)物中的泛過(guò)敏原。

孫一帆等[29]通過(guò)制備抗凡納濱對(duì)蝦過(guò)敏原精氨酸激酶的多克隆抗體，并與17種常見(jiàn)有殼水生動(dòng)物粗提液進(jìn)行Western blotting，以分析該過(guò)敏原的免疫交叉反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦40 kD過(guò)敏原為精氨酸激酶；其氨基酸序列同源性分析顯示AK在蝦類（96%～100%）、蟹類（91%～93%）、貝類（49%～52%）、蟑螂（83%）中具有很高的同源性；Westerm botting結(jié)果顯示抗AK多抗與17種不同蝦類、蟹類、貝類的AK均能發(fā)生反應(yīng)。結(jié)論：精氨酸激酶在甲殼類動(dòng)物、軟體動(dòng)物甚至昆蟲中具有高度保守性，且能引起強(qiáng)免疫交叉反應(yīng)，是有殼水生動(dòng)物中的一種泛過(guò)敏原。

3.2 外源物質(zhì)對(duì)精氨酸激酶的影響

過(guò)量的天冬氨酸會(huì)誘導(dǎo)精氨酸激酶的去折疊，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化，活性喪失，但是這種失活隨著天冬氨酸濃度的降低而復(fù)性，同時(shí)，氯化鉀可使天冬氨酸誘導(dǎo)去折疊的精氨酸激酶變成溶態(tài)的球狀蛋白質(zhì)分子[30]。

在過(guò)氧化物的壓力下，與對(duì)照組相比，處理過(guò)的克氏錐蟲精氨酸激酶的表達(dá)量有了明顯地提高。這些發(fā)現(xiàn)證明精氨酸激酶參加了抗氧化能力的反應(yīng)。同理，在硫化物的壓力下，精氨酸激酶的活性顯著升高[31]。劉陶陶等[32]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的Cu2+對(duì)于精氨酸激酶活力影響結(jié)果：二價(jià)銅離子對(duì)精氨酸激酶有明顯的活力抑制作用，而在同樣條件下同等濃度的Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價(jià)金屬離子則不會(huì)使精氨酸激酶出現(xiàn)失活且進(jìn)一步改變不同的銅離子濃度；監(jiān)測(cè)精氨酸激酶活力隨時(shí)間的變化過(guò)程，可以發(fā)現(xiàn)，精氨酸激酶在Cu2+作用下，隨著Cu2+濃度的升高，精氨酸激酶失活的速度也會(huì)加快。對(duì)于凡納濱對(duì)蝦的精氨酸激酶而言，低濃度的Na+、K+也表現(xiàn)出激活作用，這種作用隨著濃度的升高而消失，而Cu2+與Mn2+則表現(xiàn)出完全的抑制。對(duì)于龍蝦（H.Vulgarus）精氨酸激酶，Mn2+、Mg2+對(duì)催化反應(yīng)有利，而Cu2+、Zn2+均不能參與此催化反應(yīng)[33-34]。

由此可知，由于生長(zhǎng)環(huán)境不同，不同物種其精氨酸激酶的外源促進(jìn)物或抑制物有所不同。對(duì)于雙亞基AK，人們還研究了陰離子對(duì)催化其正向反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，NO3-、ClO4-、SCN-、Br-、Cl-和乙酸根對(duì)其所催化反應(yīng)的抑制性依次降低[35]。

4 展望

我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，而一直以來(lái)因?yàn)槭秤眠@類食物而導(dǎo)致的過(guò)敏癥狀屢見(jiàn)不鮮，其發(fā)病率也逐步上升。隨著食品加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們開(kāi)始關(guān)注如何通過(guò)加工的方式降低或是去除食物中過(guò)敏原的致敏性。當(dāng)前應(yīng)用于食物過(guò)敏原的加工脫敏方法主要有物理、化學(xué)、生物學(xué)方法，利用這些方法可破壞或修飾過(guò)敏原的抗原表位，改變過(guò)敏原抗原表位決定簇，從而達(dá)到降低食物過(guò)敏原性的目的。因此，明確蛋白的致敏表位及其變化規(guī)律是脫敏改性加工的研究基礎(chǔ)。

針對(duì)水產(chǎn)業(yè)，相關(guān)研究人員對(duì)水產(chǎn)過(guò)敏原開(kāi)展了一系列研究。國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)主要過(guò)敏原原肌球蛋白研究比較透徹，對(duì)次于原肌球蛋白的精氨酸激酶的研究較少，到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)精氨酸激酶的過(guò)敏原表位信息研究并不深入。因此，下一步應(yīng)以甲殼類水產(chǎn)品中重要過(guò)敏原精氨酸激酶為對(duì)象，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組學(xué)、分子生物學(xué)等方法展開(kāi)深入研究，闡釋AK的抗原表位與致敏機(jī)制，從根源上解決過(guò)敏問(wèn)題，保障過(guò)敏患者的營(yíng)養(yǎng)健康。