楊志剛,湯德元,廖少山,張森,韓超逸,晏仁潭
(貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)
CSFV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivurts),其完整的病毒粒子呈球型,直徑為38~50 nm,核衣殼呈立體對稱的二十面體結構,直徑約為29 nm,病毒囊膜表面延伸出許多長為6~8 nm含糖蛋白的纖突結構。CSFV為單鏈正鏈RNA病毒,基因組約為12.3 kb,含有一個開放閱讀框編碼大約3 898個氨基酸的多聚蛋白,該多聚蛋白經(jīng)病毒蛋白酶和宿主蛋白酶裂解為12種成熟蛋白,包括4種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1]。相關研究證明,CSFV非結構蛋白在其感染致病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,CSFV各主要蛋白協(xié)同促進了疾病的發(fā)展進程。因此,本文對CSFV感染過程中各非結構蛋白的相關調(diào)控作用機制進行了綜述。
Npro蛋白是 CSFV編碼的第一個蛋白,分子量大小約為23 kDa,由168個氨基酸殘基組成。Npro在抑制I型和III型干擾素、促進CSFV復制、提高病毒毒力以及抗細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用。
在逃避宿主先天免疫方面,Npro能抑制宿主中I型和III型干擾素的產(chǎn)生。有研究表明,Npro可以通過蛋白酶體途徑降解IRF3以及與IRF7相互作用,從而降低I型干擾素的產(chǎn)生,進而來逃避先天免疫[2],并協(xié)同病毒復制,從而增強了CSFV的致病性[3]。隨后,Gottipati等[4]將IRF3和重組純化的CSFV Npro置于緩沖液中直接進行反應,發(fā)現(xiàn)Npro能夠直接結合IRF3單體和二聚體,并且不依賴其活性狀態(tài)。Cao等[5]研究發(fā)現(xiàn)Npro通過抑制IRF1表達及其核易位進而抑制III型干擾素的產(chǎn)生。
Npro與病毒毒力有關,且在抗細胞凋亡和促進CSFV生長方面發(fā)揮作用。Mayer等在2004年發(fā)現(xiàn)缺乏Npro的CSFV突變體在體外和體內(nèi)都被減毒,證明Npro與CSFV的毒力有關。之后,Li等[6]表達位于細胞質中的IRF3-Npro融合蛋白的突變體vSM-IRF3,并發(fā)現(xiàn)由于Npro核定位的破壞,vSM-IRF3在體外和體內(nèi)毒力明顯減弱,證明了上述觀點,同時還發(fā)現(xiàn)Npro的核定位對于細胞中的有效復制至關重要。Johns等[7]為了闡明Npro的功能機制,進行了酵母雙雜交篩選,其中鑒定了抗凋亡蛋白HAX-1,通過共沉淀試驗證實Npro-HAX-1相互作用,在共轉染的細胞以及用野生型CSFV感染的轉染細胞中觀察到HAX-1,而在Npro缺失的CSFV感染細胞中未觀察到HAX-1,結果證明Npro通過與HAX-1相互作用,在抑制RNA誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Li等[8]發(fā)現(xiàn)poly(C)結合蛋白1(PCBP1)為CSFV Npro的新型相互作用蛋白,敲除PCBP1抑制了CSFV生長,而PCBP1的過度表達促進了CSFV生長,此外,I型干擾素被PCBP1和Npro下調(diào),結果表明PCBP1正向調(diào)節(jié)CSFV的生長。
P7蛋白是一種病毒孔蛋白,分子量大小約為7 kDa,由64個氨基酸殘基構成。研究表明,P7蛋白在病毒復制、孔形成、病毒毒力、改變細胞膜通透性等方面起著重要作用。Gladue等[9]研究發(fā)現(xiàn)p7的同框刪除對病毒生長有害,這表明p7對于細胞培養(yǎng)中的病毒復制至關重要;相對于高毒力的CSFV Brescia株,p7突變病毒在豬中部分或完全減毒,表明p7在CSFV毒力中具有重要作用;模擬內(nèi)質網(wǎng)脂質組成的模型膜中的結構功能分析證實,p7是一種成孔蛋白,并且成孔活性駐留在C端跨膜螺旋中。之后,Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌或哺乳動物細胞中表達p7,導致細胞膜的通透性增加,在早期主要定位在ER上,而后期轉移到細胞膜上,缺失分析表明41~63氨基酸對于其孔蛋白的活性是必需的,以及Largo等[11]發(fā)現(xiàn)p7可以在ER的雙層膜結構模仿物上形成離子通道,并且該通道可以通過分子量為427.33的ANTS分子,這都證明了上述p7是一種成孔蛋白這一觀點。Zhao等[12]研究表明單獨的P7蛋白及其前體 E2-P7 蛋白復合體在調(diào)節(jié)蛋白相互作用和促進CSFV增殖的過程中起到重要作用,而不會影響病毒復制,這對上述p7對細胞培養(yǎng)中的病毒復制至關重要這一觀點進行了進一步證明。
NS2 蛋白由457個氨基酸殘基構成, 具有蛋白酶活性,能將NS2-3蛋白復合體切割形成NS2和NS3 2個單體蛋白,還能夠調(diào)節(jié)細胞生長、細胞周期進程和細胞凋亡,為病毒復制提供有利的環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),含有完整NS2-NS3基因的RNA復制子在轉染的細胞中持續(xù)存在并繼續(xù)復制,不會對細胞造成任何明顯的形態(tài)或功能損害,而缺少NS2基因的基因組則能夠更有效地復制并引起細胞病變作用,這些發(fā)現(xiàn)表明NS2盡管對于RNA復制不是必需的,但是在其中具有一定的調(diào)節(jié)功能。之后,Li等[13]突變了CSFV NS2 N末端的幾個代表性保守殘基,并研究了這些突變?nèi)绾斡绊懖《綬NA復制和感染性病毒的產(chǎn)生,結果表明在NS2的N端2個天冬氨酸NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K的突變消除了感染性病毒的產(chǎn)生,并且在100位(NS2/R100A)用精氨酸代替丙氨酸導致病毒滴度顯著降低,含有病毒基因組RNA分子的細胞的連續(xù)傳代產(chǎn)生了回復株NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D,感染性病毒得到恢復,這些結果揭示了CSFV NS2 N末端能調(diào)節(jié)病毒復制,證明了上述觀點。Tang等[14]建立了穩(wěn)定的表達CSFV NS2的豬臍靜脈內(nèi)皮細胞系(SUVEC),并發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于內(nèi)質網(wǎng)(ER),細胞分析顯示,由于S期細胞周期停滯,表達NS2的細胞系的復制被抑制20%~30%,NS2還誘導內(nèi)質網(wǎng)應激和激活NF-κB,這些結果證明了NS2誘導S期阻滯來調(diào)節(jié)細胞生長和細胞周期進程,從而為病毒復制提供有利的細胞環(huán)境,又進一步發(fā)現(xiàn)NS2的表達誘導內(nèi)質網(wǎng)應激和激活NF-κB之后,從而上調(diào)IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,并抑制MG132誘導的細胞凋亡,數(shù)據(jù)表明CSFV NS2在炎癥反應和持續(xù)感染中起重要作用[15]。此外,Kang等[16]利用酵母雙雜交分析出MOAP1、DNAJA1、GOPC、FANCL、TMED4和CSDE1可以與NS2相互作用,這些蛋白質主要與凋亡、應激反應、氧化還原、代謝有關,但具體作用有待進一步研究。
NS3蛋白分子量大小約為80 kDa,由683個氨基酸殘基構成,具有核苷三磷酸酶活性、絲氨酸蛋白酶活性和核糖核酸解旋酶活性,它們是轉錄和翻譯所必需的。研究表明,NS3具有解旋酶活性,在CSFV基因組復制發(fā)揮重要作用,并且NS3蛋白酶結構域和NS5B能夠調(diào)節(jié)NS3的核苷三磷酸酶活性和解旋酶活性。此外,NS3與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)相互作用,降解了TRAF6,通過NF-κB信號通路促進CSFV復制[17];NS3與TRAF5相互作用促進了TRAF5的表達,而TRAF5的表達又激活p38 MAPK,從而促進了CSFV復制[18]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)宿主細胞蛋白PSMB10通過泛素-蛋白酶體途徑降解NS3蛋白,從而抑制經(jīng)典豬瘟病毒的生長,這可能為豬瘟的治療提供一定的思路[19]。
NS4A蛋白分子量大小約為6 kDa,由64個氨基酸殘基組成,是NS2-3蛋白的輔助因子,在病毒的復制和病毒顆粒組裝中發(fā)揮重要作用。最近,Wang等[20]發(fā)現(xiàn)CSFV感染通過MAVS途徑誘導豬臍靜脈內(nèi)皮細胞表達和分泌IL-8,還證明了NS4A定位于細胞核和細胞質,且通過增強MAVS途徑誘導IL-8的產(chǎn)生,并促進CSFV復制。
NS4B蛋白分子量大小約為38 kDa,由347個氨基酸殘基組成,有2個保守的結構域,分別是WalkerA(209~216 aa)和WalkerB(335~342 aa),具有NTPase活性,能與非結構蛋白(即NS3、NS4A、NS5A和NS5B)一起形成RNA復制復合物,在病毒復制、毒力、抗細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),WalkerA對NTPase活性至關重要。Tamura等[21]研究表明NS4B對病毒的毒力有影響,可以與E2通過協(xié)同作用提高病毒的致病性,之后又進一步發(fā)現(xiàn)NS4B N末端結構域介導的細胞內(nèi)膜結合可以決定細胞培養(yǎng)中的CSFV基因組復制和豬的病毒致病性[22]。
研究發(fā)現(xiàn),NS4B可以與多種蛋白相互作用并發(fā)揮作用。Lin等[23]證明Rab5與NS4B相互作用以促進NS4B相關復合物的形成并增強CSFV增殖;Qian等[24]發(fā)現(xiàn)鐵蛋白重鏈(FHC)(一種著名的抗凋亡蛋白)是一種與NS4B相互作用的蛋白,可增強CSFV復制,并通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)細胞活性氧(ROS)來抵消細胞凋亡;研究人員[25]通過酵母雙雜交(Y2H)系統(tǒng)篩選、亞細胞共定位、共免疫沉淀和谷胱甘肽S-轉移酶下拉分析證明了坦克結合激酶1(TBK1)是NS4B相互作用的細胞蛋白,但具體作用有待進一步研究。最近,Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)豬RING指蛋白114(pRNF114)(一種RING域E3泛素連接酶)是潛在的抗CSFV因子,pRNF114通過靶向并催化NS4B蛋白的K27連接的多聚泛素化,然后促進蛋白酶體依賴性的NS4B降解,從而抑制CSFV的復制,這為開發(fā)豬瘟的治療方法提供新的思路。
NS5A蛋白分子量大小約為55 kDa,由496個氨基酸殘基組成,是一種磷酸化的多功能蛋白,能抑制NF-κB信號通路和誘導宿主細胞的自噬,在調(diào)節(jié)病毒復制方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),NS5A蛋白定位于內(nèi)質網(wǎng),通過N和C端結構域刺激病毒復制和抑制病毒翻譯。之后,Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)NS5A可以通過與NS5B和3'UTR結合而調(diào)節(jié)病毒的復制,當無法與NS5B結合時,NS5A仍可以通過與3'UTR結合來調(diào)節(jié)病毒的合成,同時,Sheng等[28]發(fā)現(xiàn)當細胞中NS5A的水平較低時,NS5A與NS5B一起結合3′UTRSL-1,促進病毒復制;而當NS5A水平較高時,NS5A蛋白除了結合3′UTRSL-1之外,還結合3′UTRSL-2,正是NS5A與3′UTRSL-2的結合可能抑制了NS5B以相同的3′UTR為模板的病毒合成,這對上述觀點進行了進一步解釋。此外,Xie等[29]研究表明NS5A可以切割形成兩科個截斷形式的b和c,通過蛋白酶抑制劑和shRNA干擾的實驗表明,caspase6蛋白酶介導形式c的切割,另一種未知蛋白酶介導形式b的切割,下調(diào)或抑制該蛋白酶的活性顯著的降低了基因組復制和病毒產(chǎn)生,證明NS5A的切割有利于病毒的復制。
研究表明,NS5A通過誘導宿主細胞的自噬和抑制NF-κB信號通路,從而促進病毒的復制和成熟。Pei等[30]研究發(fā)現(xiàn)CSFV通過誘導宿主細胞的自噬途徑從而促進病毒的復制和成熟,免疫電子顯微鏡檢查進一步證實了E2和NS5A蛋白與自噬小體樣囊泡的共定位,所以NS5A可能對CSFV誘導自噬具有重要意義,但其機制尚待闡明。Dong等[31]發(fā)現(xiàn)在豬肺泡巨噬細胞中,CSFV NS5A通過抑制NF-κB信號通路抑制poly(I:C)誘導的炎癥細胞因子分泌,這可能有助于尋找新的方法來預防CSFV感染。
NS5A能與宿主細胞中多種蛋白發(fā)生相互作用,從而增強病毒復制,同時也發(fā)現(xiàn)一些蛋白能與NS5A相互作用,從而抑制病毒復制,這可能有助于開發(fā)新的方法來治療CSFV感染。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)熱激蛋白70與CSFV NS5A的N末端氨基酸(29240)蛋白相互作用,并增強病毒復制;Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)FKBP8和CSFV NS5A相互作用,并促進病毒復制;Liu等[34]研究表明真核生物翻譯起始因子3亞基E(eIF3E)與CSFV NS5A相互作用,并促進病毒復制。Li等[35]發(fā)現(xiàn)真核延長因子1A(eEF1A)與CSFV NS5A蛋白相互作用,并抑制病毒的生長;Ling等[36]研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27(Hsp27)與CSFV NS5A相互作用,并通過NF-κB信號通路抑制病毒復制;毒蛇毒蛋白通過與CSFV NS5A相互作用,并抑制病毒復制[37]。
NS5B分子量大小約為82 kDa,由718個氨基酸殘基組成,是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),負責病毒基因組的復制。Xiao等[38]研究發(fā)現(xiàn)NS5B蛋白通過3′UTR與正鏈結合形成復合物,從而促進CSFV復制,且發(fā)現(xiàn)CSFV正鏈RNA的3′UTR“CCCGG”序列和負鏈RNA 3′UTR“CATTGCTC”序列是正鏈RNA和負鏈RNA合成必需的。Li等[39]研究結果進一步表明CSFV核心蛋白通過CSFV NS5B調(diào)節(jié)RNA的合成。此外,其他非結構蛋白與NS5B之間的相互作用在病毒的生命周期中發(fā)揮了重要作用。例如,Wang等[40]研究發(fā)現(xiàn)CSFV NS3通過與NS5B結合增強RdRp活性,也調(diào)節(jié)NS3的 NTP酶活性和解旋酶活性,之后,又進一步發(fā)現(xiàn)NS5B包含2個NS3結合位點,一個為NS5B N端的63~99 aa和另一個為C端的611~642 aa[41]。最近,Li等[42]通過對CSFV NS5B的晶體結構的研究,發(fā)現(xiàn)CSFV NS5B的N末端結構域(NTD)對于RdRp活性非常重要;Zhou等[43]研究發(fā)現(xiàn)豬poMx1與CSFV NS5B相互作用,抑制CSFV復制。這可能對開發(fā)抗CSFV藥物提供一定的思路。
CSFV對我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的損失,研究人員近些年對于CSFV的研究已取得了顯著進展,但對在CSFV復制中發(fā)揮重要作用的如p7、NS2、NS3等非結構蛋白的研究還不透徹,非結構蛋白之間相互作用的調(diào)控機制、病毒復制的調(diào)控機制及致病機理等方面都需要不斷進行探索。對CSFV非結構蛋白的了解,有助于深入理解病毒的復制過程及病毒持續(xù)感染的分子機制。本文對在CSFV復制過程中起關鍵作用的非結構蛋白近年來的研究進展進行了匯總,以期為今后繼續(xù)研究CSFV非結構蛋白的科研人員提供參考,并對CSFV的鑒定、診斷及預防研究提供參考。