陳軍平 王德偉 譚偉源 袁小洪 余杰鋒

遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519100

骨質疏松癥是一種普遍性的骨骼疾病，其特征是骨骼強度受損，骨骼數(shù)量和質量下降，通常導致脆性骨折[1]。隨著全球人口的老齡化，骨質疏松癥已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。目前，根據(jù)研究的人群，全世界約有2億人患有骨質疏松癥，其發(fā)病率已在所有常見疾病中躍升至第七位，患病率為10 %～58 %。隨著經濟持續(xù)的發(fā)展，中國人口正在迅速老齡化[2]，并且由于年齡是骨質疏松癥的主要危險因素之一，因此骨質疏松癥對公共衛(wèi)生的威脅在中國變得越來越重要[3]。硫化氫(H2S)是一種無色有毒氣體，散發(fā)著腐爛雞蛋的惡臭，是調節(jié)各種生理或病理細胞功能的重要氣體遞質[4]。近年來的研究表明H2S對骨量的維持有重要作用[5-7]。GYY4137(一種H2S)可以通過調節(jié)鈣通道中Ca2+內流來控制干細胞的功能，而GYY4137的缺乏損害了干細胞的成骨分化[5]。最近的研究表明，GYY4137保護成骨細胞免受H2O2或糖皮質激素誘導的細胞損傷[8]。然而，其對老年骨量流失的影響尚不清楚，需要進一步研究。本研究的目的是觀察GYY4137對年齡引起的骨量流失的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組和治療

3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠10只，體重230～250 g作為對照組(Con)及24月齡雌性Sprague-Dawley大鼠20只，體重487～532 g購于上海實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)在室溫(23±2)℃，12/12 h光暗循環(huán)，喂食標準大鼠飼料和水。老年大鼠隨機分為模型組(Mod，n=10)和治療組(Tre，n=10)。所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，Tre組給予100 μg/kg的劑量腹腔注射GYY4137 (GYY4137購自Santa Cruz Biotechonology，SC-224013)并用0.9 %生理鹽水稀釋)，每2天1次，治療12周，在治療結束，在禁食12 h后對大鼠實施安樂死。

1.2 生化檢測

在治療結束通過頸椎脫位處死大鼠。處死后從下腔靜脈抽血，加入抗凝劑后，以3 000 r/min的速度離心20 min以提取血漿。將提取的血漿儲存在-70 ℃?zhèn)溆谩２捎肕DA (μmol/mL),GSH (μmol/mL)和SOD (U/L)試劑盒(南京建城，中國南京)按廠家說明書評價血清氧化應激活性。采用ROS ELISA試劑盒(中國上海聯(lián)碩生物科技)檢測血清ROS (U/mL)水平。

1.3 組織學和影像學檢查

治療結束處死大鼠后取下右側股骨，使用高分辨率Micro-CT掃描系統(tǒng)(GE Locus SP)以標準分辨率模式掃描股骨遠端。從生長板遠端0.2 mm開始的中心區(qū)域的15 mm2區(qū)域進行骨測量，以評估骨質量、密度和小梁的微結構。興趣量(VOI，29 μm*29 μm*29 μm)使用半自動輪廓法選擇。生成一系列平面橫向灰度值圖像。所有圖像都用于重建三維圖像。使用Micro-CT系統(tǒng)中的軟件來計算VOI內的參數(shù)：骨密度(BMD)、骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

在Micro-CT掃描后，清除附著的結締組織后，將股骨浸入梯度酒精(70 %、95 %和100 %乙醇，每種情況下3 d)以進行組織脫水。將骨樣品包埋在含有甲基丙烯酸甲酯的樹脂中。用裝備有碳化鎢制成的刀片(型號RM2255；Leica Nussloch，德國)的半自動旋轉切片機對樹脂包埋的樣品進行縱向切片。用Goldner三色染色劑對厚度為7 μm的骨切片進行染色，并在光學顯微鏡下(日蝕Ni-U型；尼康)使用OsteoMeasure系統(tǒng)(版本4.10；OsteoMetrics，喬治亞州亞特蘭大)進行分析。

1.4 蛋白印跡(WB)分析

使用細胞裂解試劑盒(Beyotime，Jangsu，China)提取股骨遠端總蛋白，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜與特異性抗體孵育，并使用ECL檢測試劑盒(Beyotime，江蘇 中國)進行檢測。使用Image Lab Version 2.1(Bio-Rad)軟件通過密度分析量化蛋白質表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用Mann-WhitneyU檢驗比較各組大鼠血清各指標。用Friedman分析評價各組指標的變化。采用Wilcoxon秩和檢驗對各組參數(shù)進行分析。采用卡方檢驗比較各組的組織學參數(shù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氧化應激指標比較

與Con組相比，Mod組大鼠血清丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平明顯升高，谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)明顯降低；Tre組大鼠血清MDA和ROS水平明顯降低，GSH和SOD水平明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：與Con組相比，*P<0.05;與Mod組相比，#P<0.05。圖1 各組大鼠血清氧化應激指標水平Fig.1 Serum oxidative stress index levels in each group of rats

2.2 組織學分析

股骨干骺端骨小梁結構如圖2所示，Con組大鼠股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁網狀結構正常。Mod組大鼠骨小梁變薄，導致骨小梁間隙變寬。Tre組大鼠骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，骨小梁結構大都恢復。

圖2 三組股骨的組織病理學(10*)Fig.2 Histopathology of the femurs in the three groups(10*)

2.3 Micro-CT檢測結果

每組中的大鼠股骨干骺端微結構如圖3 A所示，股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖3 B～F所示。Mod組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Con組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。Tre組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于Mod組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于Mod組(P<0.05)。

2.4 蛋白印跡結果

治療12周后，三組股骨均進行Atg 5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62蛋白表達檢測，結果顯示Tre組Atg 5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1的蛋白表達明顯高于Mod組(P<0.0 5)，而p62顯著低于Mod組(P<0.0 5)，見圖4。

注：與Con組相比，*P<0.05；與Mod組相比，**P<0.05。圖3 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果Fig.3 Results of micro-CT in the femoral metaphysis in the three groups of rats

注：與Con組相比，*P<0.05；與Mod組相比，**P<0.05。圖4 WB分析示Atg 5、PLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的蛋白表達Fig.4 Protein expressions of Atg 5，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin1,and p62 analyzed with Western blotting

3 討論

本研究使用年齡誘導骨量流失大鼠作為研究模型，通過GYY4137治療12周后，檢測大鼠骨量和氧化應激指標丙二醛和超氧化物歧化酶、髓過氧化物酶和活性氧水平改變；同時檢測股骨遠端自噬狀態(tài)的重要標志蛋白的表達情況；結果表明在GYY4137治療12周后，大鼠股骨骨密度及骨小梁微觀參數(shù)顯著改善；同時發(fā)現(xiàn)大鼠的氧化應激水平下降以及自噬水平降低；本研究表明GYY4137可能通過影響自噬水平和氧化應激狀態(tài)來改善老年大鼠的骨量和骨密度。

氧化應激，由于過度產生活性氧損害細胞成份，研究認為氧化應激在骨質疏松發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用[9]。本研究中老年大鼠體內的氧化應激指標丙二醛和髓過氧化物酶、超氧化物歧化酶在GYY4137治療后出現(xiàn)顯著降低；表明治療后老年大鼠體內氧化應激水平降低。自噬是一種重要的細胞應激反應機制，除了細胞凋亡外，自噬是一種細胞保護機制，也是細胞程序性死亡的另一種方式。先前的研究[10]表明，骨細胞中存在自噬，當骨細胞在體外受到缺氧或糖皮質激素的干預時時，自噬起到了保護作用。目前，研究普遍認為活性氧物種誘導自噬[11]，而自噬在幾種病理條件下起到減少氧化損傷的作用[12]。抗氧化劑的減少可能與多種原因有關；E2缺乏癥，清除自由基的能力下降，白介素6和腫瘤壞死因子α升高[13]。Melville等[14]首先報道骨細胞自噬，通過清除氧自由基對氧化應激具有保護作用[12]。在成骨細胞特異性雌激素受體基因敲除小鼠中觀察到成骨細胞自噬水平升高。本研究的發(fā)現(xiàn)與早期報道一致，H2S產量降低可能會增強骨骼中氧化應激的作用[8]。

GYY4137是一種緩慢釋放的H2S供體，已被廣泛用于研究H2S在生物過程中的作用[8]。我們使用GYY4137治療來預防年齡引起的骨質流失。GYY4137可以恢復了游離H2S的水平，并通過經典Wnt信號通路、Erk信號通路防止了股骨干骺端骨小梁丟失和骨密度降低[5-7]。與該發(fā)現(xiàn)一致的是，本研究表明老年大鼠骨細胞的自噬增加。本研究表明老年大鼠骨骼中Atg5、LC3和Beclin1蛋白質水平在H2S治療后明顯降低，而p62的水平明顯增加。這些數(shù)據(jù)表明自噬可能是骨量流失條件下對急性炎癥和應激的反應機制。此外，本研究自噬水平下降而抗氧化生物標志物(髓過氧化物酶活性)出現(xiàn)提高。本研究結果表明自噬對氧化應激具有保護作用，這與多項研究[14]一致?？寡趸饔玫目赡軝C制是自噬可以去除氧化的蛋白質，活性氧和受損的線粒體[15]。此外，我們的研究表明GYY4137治療后出現(xiàn)自噬水平降低，而骨量和BMD出現(xiàn)升高。這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究表明自噬與骨遠端骨密度顯著相關一致[16]。在本研究中，由于老年大鼠體內雌激素顯著降低，導致骨組織中抗氧化生物標志物的減少和自噬水平的提高，而GYY4137處理可以部分逆轉這種作用。這表明是自噬不僅受雌激素的調節(jié)，還受其他細胞因子、氧自由基等的調節(jié)。

考慮到自噬與氧化應激狀態(tài)、骨質流失的關系，GYY4137治療后出現(xiàn)骨量增加，表明GYY4137是骨代謝的潛在候選者，GYY4137可以通過改善自噬和氧化應激水平來預防年齡引起的骨質流失，后期會進一步探索可能的機制。